[发明专利]一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用

说明书

本发明公开了一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用，属于生物工程领域。为了提高定量金山醋酸乳杆菌含量的准确性、稳定性和可靠性，节省定量的时间。本发明提供了一对特异性强，有效性好，准确性高的金山醋酸乳杆菌的分子标记和特异性定量金山醋酸乳杆菌的试剂盒，并构建了一种用于醋醅、酒醅、食醋样品中金山醋酸乳杆菌的快速鉴定、准确定量的实时荧光定量PCR方法，有助于在酿造生产过程或酿造产品中对该细菌的特异性定量和定性监测。

技术领域

本发明涉及一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

金山乳杆菌(Lactobacillus jinshani)是从传统食醋醋酸发酵过程醋醅中分离获得的乳酸菌新物种，细胞为革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性和氧化酶阴性，杆状，无运动性和无芽孢形成，能够在20℃-40℃(最适35℃)，pH 3.0-5.0(最适4.0)，0％-5％氯化钠浓度(最适0％)，有氧/厌氧/微需氧条件下生长，产生D-乳酸和L-乳酸。随后，科研人员以乳酸菌科和明串珠菌科的全基因组序列为基础，通过评估其核心基因组系统发育、平均氨基酸特性、生理标准等将乳杆菌属(Lactobacillus)重新划分为25个新属，系统发育分析表明金山乳杆菌形成了一个单独的谱系，被重新命名为金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillusjinshanensis)，为醋酸乳杆菌属(Acetilactobacillus)的模式种，且为目前的唯一种。

根据已有研究报道，金山醋酸乳杆菌可在传统食醋、白酒发酵过程大量存在，属于酿造功能微生物。常规扩增子测序技术可以解析样本的物种组成和其相对丰度信息，对微生态研究具有重要的促进作用，但是微生物的相对丰度往往忽视了不同样本之间微生物量存在的差异，而绝对定量分析则是计量样本每种微生物的16S基因拷贝数或者数目，更能反映样本每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异，因此在酿造微生物群落中对金山醋酸乳杆菌进行特异性定量分析将有助于酿造生产过程的监测与优化。

对醋醅中微生物定量检测的方法，一般采用选择培养基的筛选和纯培养分离计数的方法，但是，该方法受到外界环境因素，菌种特性等影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时费力。普通的菌体应用CFU法即平板计数法，将样品稀释后直接涂布于平板上，然后对平板上的菌落进行计数。但是将厌氧培养4天的金山醋酸乳杆菌菌液稀释涂布平板对其进行计数，期望平板计数的数量与菌液浓度呈线性关系，但结果是两者线性关系极差，并不是稀释倍数越高，菌落数越少，是不适合使用平板计数法对其进行定量的，由于金山醋酸乳杆菌为从传统食醋酿造过程筛选得到的新物种，目前对于其在固体平板上生长的规律未可知，且其培养条件较特殊。

发明内容

本发明的目的是特异性的定量和定性检测金山醋酸乳杆菌，既提高检测金山醋酸乳杆菌含量的准确性、稳定性和可靠性，又节省定量的时间，解决传统微生物特异性检测的不足。本发明提供了一种SEQ ID NO：16所示的分子标记作为鉴定金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillus jinshanensis)的标志物的应用。

在一种实施方式中，SEQ ID NO：16所示的分子标记作为特异性定量金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillus jinshanensis)标志物的应用。

本发明还提供了一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO：1～2所示的引物对，所述引物对可以扩增SEQ ID NO：16所示的分子标记。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括SYBR Green Master Mix、标准品DNA和ddH₂O。

在一种实施方式中，所述标准品DNA是含有SEQ ID NO：16所示的分子标记的质粒。

本发明还提供了一种特异性定量金山醋酸乳杆菌的方法，所述方法的具体步骤如下：

(1)提取待检测样本中微生物的总DNA；