[发明专利]一种农药诱导蛋白互作和诱导基因表达的方法

说明书

本申请公开了一种农药诱导蛋白互作和诱导基因表达的方法，所述农药为双炔酰菌胺，诱导蛋白互作为诱导绿色荧光蛋白三片段互补，诱导基因表达为诱导绿色荧光蛋白编码基因表达；提供的ABI‑CP是使用双炔酰菌胺控制蛋白互作的一种拓扑结构变异体，突破已有方法对于融合蛋白空间相对位置的限制；利用双炔酰菌胺调控基因表达的方法，由于农药化合物自身的特性，突破了现有诱导基因表达的化合物的局限性。这些局限包括成本高，环境中不可大量使用，非生理中性（可被快速代谢），不易进入细胞起效等。

技术领域

本发明涉及于基因表达调控技术领域，尤其涉及一种农药诱导蛋白互作和诱导基因表达的方法。

背景技术

蛋白分子相互作用是各种生物学过程的基础。检测和操纵蛋白质分子互作是检测和控制生物体内信号转导等生物学功能的常用手段。例如利用某种化合物分子诱导两个蛋白分子互作，则与这两个蛋白融合表达的荧光蛋白空间位置被拉近，可以通过荧光共振转移检测该化合物的存在或浓度。又如，如果两个蛋白受光诱导发生互作，这两个蛋白可以与一对效应蛋白分别构建为融合蛋白，利用光照来控制效应蛋白互作、行使功能。这种方法已经成为光遗传学技术的重要组成部分。

农药化合物具备普通化合物无法比拟的优势。农药已经通过环境安全管理审批，对动、植物，微生物等的生物学作用和毒理作用清晰。同时农药在应用方面具有成本低、规模大，效率高等优势。因此，开发农药诱导的蛋白互作方法，使农药控制基因表达等生物学过程成为可能。

双炔酰菌胺是先正达公司开发的专门针对卵菌的低毒高效农药“瑞凡”的主要成分。之前已经有研究组开发出能够受双炔酰菌胺诱导互作的蛋白，并应用于植物和动物细胞控制效应蛋白互作，进而控制植物激素脱落酸信号转导，动物细胞内蛋白亚细胞定位改变等生物学过程。已有的方法使用PYR1^MANDI和氨基端截短的HABI蛋白（已下称为HAB）互作，或者PYR1^MANDI和氨基端截短的ABI1（以下称为ABI, 系HAB1蛋白的同源蛋白）互作。

但是已有的方法有个两个局限。第一个局限是ABI蛋白的氨基末端和羧基末端在空间上相邻，位于ABI蛋白同侧，而与ABI互作的PYR1^MANDI羧基末端位于ABI蛋白空间上相对的另一侧，空间距离超过67埃（PDB登录号3NMN），空间位阻大，PYR1^MANDI和ABI1互作后不利于拉近效应蛋白。PYR1^MANDI氨基末端距离ABI蛋白的氨基末端或羧基末端就更远了。第二个局限是对于目前双炔酰菌胺诱导基因转录激活方法不多。已经报道在酵母细胞中通过酵母双杂交系统将 PYR1^MANDI和HAB或ABI互作转化为转录激活信号。但这种策略受到酵母双杂交原理限制，不具有普适性。

发明内容

本发明提供一种农药诱导蛋白互作和诱导基因表达的方法，解决现有诱导蛋白互作的化合物作为基因表达诱导剂的局限性，使用双炔酰菌胺控制蛋白互作的另一种空间位置变异体，突破已有方法在蛋白质空间相对位置上的限制。

本发明采用以下技术方案：

一种农药诱导蛋白互作和诱导基因表达的方法，所述农药为双炔酰菌胺，诱导蛋白互作为诱导绿色荧光蛋白三片段互补，诱导基因表达为诱导绿色荧光蛋白编码基因表达，步骤为：

步骤1：在质粒1基础上构建质粒2，ABI-CP氨基端融合GFP10，PYR1^MANDI羧基端融合GFP11；

步骤2：构建质粒3，由T7启动子_lacO在大肠杆菌中控制诱导表达GFP1-9片段，以匹配大肠杆菌BL21(DE3)菌株的IPTG诱导系统；

步骤3：将质粒2和3转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株；