[发明专利]一种用于含微血管管腔的双层皮肤培养的培养液

说明书

本发明制备的一种含微血管管腔双层皮肤，具有两层皮肤结构，自上而下分别为表皮层，含有微血管管腔的真皮层；表皮层由表皮细胞生发复层组成，含有微血管管腔的真皮层由成纤维细胞、脐带间充质干细胞、脐静脉内皮细胞构建而成，其通过将成纤维细胞、脐带间充质干细胞以及脐静脉内皮细胞以一定比例混合，使用多次接种法，利用细胞自身胞外基质分泌能力和旁分泌系统，一方面形成皮肤真皮的组织学结构，另一方面促进内皮细胞的增殖，迁移，管腔形成及稳定。这种模拟正常人体皮肤组配，通过细胞间相互作用和相互影响达到真皮层构成及真皮内微管腔形成的组织构建方法，避免了人为添加外源支架及血管前新生因子所带来结构和功能的不稳定以及操作的繁琐。

本分案申请是基于申请号201510619910.2，申请日为2015年9月25日，发明名称为“一种含微血管管腔的双层皮肤及其制备方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医学工程中组织工程技术领域，主要涉及一种含微血管管腔的双层皮肤及其制备方法。

背景技术

正常皮肤细胞对氧气和营养的需求、代谢废物的清除是靠细胞附近的血液扩散和运输作用实现，而目前基于成纤维细胞复合支架材料和表皮细胞构建的双层皮肤因缺乏血管结构，无法满足长期存活及功能性的要求，导致成纤维细胞的功能失调，角化细胞的迁移能力和增殖能力降低，最终造成皮肤组织的功能受限；将构建好的双层皮肤移植到创面上，由于双层皮肤中活细胞营养成分的获取和废物的排泄主要依靠创面基底的渗液完成，因此细胞的物质交换速度慢，严重影响双层皮肤中活细胞的存活及其功能的实现。含血管皮肤除了提高皮肤存活时间及功能之外，这种具有分化结构的双层皮肤还可以用于血管机制的基础科学研究，以及筛选对血管生成有抑制或促进作用的药物。

因此，如何构建出含有血管的双层皮肤及加速人工真皮替代物血管化引起广大研究者的关注。现有的血管化工程皮肤多数都是以细胞外基质（ECM）替代物为支架进行构建，例如2004年5月，金岩等人申请了有关专利（中国专利申请号03134540.9），该发明利用Ⅰ型胶原作为支架结构构建了含有血管结构的组织工程皮肤。细胞外基质替代物尽管能构成细胞生长的外部微环境，但同时也带来很多外源性物质，例如牛胶原，同种异体真皮层、人造聚合物等，这些都存在一定的缺陷，即不同外源性物质的免疫原性，降解率，降解产物的毒性，宿主免疫应答，支架降解引起的组织纤维化，以及同周围组织机械性的不匹配，都可能成为影响构建皮肤结构的长期生物活性以及主要生物功能的关键因素。并且细胞外基质替代物均并非是由细胞自身分泌，外源性的添加不利于细胞间信号的传导，进而影响构建皮肤的结构及功能发挥。

另外，目前构建含微血管的双层皮肤模型主要在以成纤维细胞为主的真皮层加入内皮细胞，同时添加血管前新生因子以促进皮肤内的血管生成。现常用的添加因子有：血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)以及血小板源性生长因子(PDGF)等，此方法经常需要重复实施或严格控制释放系统，例如所添加因子的浓度，不同添加因子间的配比以及各个因子作用时间等，这些均不可避免的造成整个构建过程的复杂性及不稳定性，在一定程度上限制了其应用。发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提出一种含微血管管腔的双层皮肤及其制备方法，通过将成纤维细胞，脐带间充质干细胞以及脐静脉内皮细胞以一定比例混合，使用多次接种法，利用细胞自身胞外基质分泌能力和旁分泌系统，一方面形成皮肤真皮的组织学结构，另一方面促进内皮细胞的增殖，迁移，管腔形成及稳定。这种模拟正常人体皮肤组配，通过细胞间相互作用和相互影响达到真皮层构成及真皮内微管腔形成的组织构建方法，避免了人为添加外源支架及血管前新生因子所带来结构和功能的不稳定以及操作的繁琐。

本发明制备的含微血管管腔双层皮肤，具有两层皮肤结构，自上而下分别为表皮层，含有微血管管腔的真皮层；所述表皮层由表皮细胞生发复层组成；所述含有微血管管腔的真皮层由成纤维细胞、脐带间充质干细胞和脐静脉内皮细胞构建而成。

本发明所提出的含微血管管腔双层皮肤的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的提取：