[发明专利]一种融合了单细胞TCR测序数据的肿瘤新生抗原筛选方法

说明书

本发明公开了一种融合了单细胞TCR测序数据的肿瘤新生抗原筛选方法，包括：基于全外显子测序数据及转录组测序数据通过软件进行质控、比对等步骤获取新生突变肽库；使用HLA分型预测软件预测HLA‑I类分型；结合单细胞TCR测序及单细胞转录组测序，通过细胞类型注释、克隆频率分析寻找癌症特异性的CD8+T细胞受体；同时，基于集成深度学习通过peptide‑TCR相互作用预测模型鉴定短肽免疫原性，提出融合单细胞TCR测序数据的肿瘤新生抗原筛选方法，解决了传统肿瘤抗原筛选方法新生抗原错选漏选率高、免疫原性不足等问题。

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗性疫苗领域，具体涉及一种融合了单细胞TCR测序数据的肿瘤新生抗原筛选方法。

背景技术

肿瘤的发生经常伴有多个基因的突变，新生抗原指的是由肿瘤细胞突变所产生的表位特异性抗原，只在肿瘤细胞上表达，从而不会导致机体的免疫耐受。肿瘤免疫治疗过程中，T细胞在监测杀死病理细胞方面起着不可或缺的作用。T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别由HLA蛋白呈现的短肽，以抗原特异性的方式应对威胁。经典的CD8+T细胞，也被称为细胞毒性T细胞，识别HLA类I(HLA I)分子呈现的短肽，而CD4+ T细胞只识别HLA类II(HLA II)分子呈现的肽。这一过程被称为抗原识别，这是引起有效免疫反应的关键步骤。已有较多的研究显示以新生抗原为靶标的免疫治疗包括细胞免疫治疗和疫苗免疫治疗，在一些癌症患者上已经取得了不错的临床效果，因此筛选鉴定出肿瘤特异性“新生抗原”是mRNA肿瘤治疗性疫苗设计的关键环节，是实现个体化免疫治疗的基础。

传统经典的肿瘤特异性新生抗原筛选策略为：首先，使用下一代测序(NGS)平台全外显子测序或全基因组测序对原发性肿瘤的非同义突变进行表征；其次，利用RNA-seq测序获得患者HLA分型；最后，通过肽段与HLA复合物(pHLA)的结合亲和力预测工具--NetMHC、NetMHCstabpan、NetMHCPan，筛选高结合亲和力的突变肽序列。此策略基于癌症活检和正常组织的外显子测序数据，通过pHLA结合亲和力大小筛选潜在的同种异型特异性HLA配体，利用转录组数据表征抗原丰度，可以大大减少候选肽的数量，从而加速新表位实验验证进程，已成功应用于黑色素瘤患者的个体化新生抗原疫苗的研发，取得了不错的临床效果。然而，传统肿瘤新生抗原筛选方法未考虑T细胞作用，未基于T细胞免疫组库测序数据分析候选肽的免疫原性，导致只有极少数的短肽能引发有效的免疫反应，对大量候选肽的免疫活性再进行免疫学实验验证，费时费力。因此，融合T细胞免疫组库测序技术，重塑肿瘤新生抗原筛选体系，以筛选鉴定T细胞反应靶向的肿瘤特异性抗原肽，这将是肿瘤治疗性疫苗设计的一个范式转变。

此外，肿瘤新生抗原精准识别模型与算法是肿瘤新生抗原筛选的核心技术，一直是肿瘤治疗性疫苗领域的研究热点、难点问题。当前肿瘤新生抗原识别算法主要基于肽与HLA的结合亲和力数据及肽质谱测序数据建立，模拟哪些肽能被HLA分子呈递，结合抗原处理与转运数据能在一定程度上提升pHLA结合精准度。然而，通过当前新生抗原识别算法预测的大多数新生抗原在活体内不能引起免疫反应，识别免疫原性肽目前仍是一个未解决的问题。原因在于，与免疫原性相关的两个特征分别为pHLA复合物的稳定性和与其相互作用的T细胞受体(TCR)的功能亲和力,当前算法只能度量pHLA复合物的稳定性，而不能预测T细胞受体与抗原肽的相互作用。与抗体及其配体相比，抗原肽与TCR间相互作用的亲和力较低，需要特别敏感的生化技术来检测。而且，对所有潜在的免疫原性多肽进行实验测试耗时、耗力、费用高。因此，开发TCR识别的免疫原性肽的高通量预测方法是当务之急，以快速准确地识别免疫原性肽,这将对传染病、疫苗设计及癌症免疫学等许多研究领域产生革命性的影响。

市场需要一种免疫原性肿瘤新生抗原智能化筛选技术，为mRNA肿瘤治疗性疫苗研发提供理论指导与技术支持，本发明解决这样的问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术中存在的缺陷，提供一种融合了单细胞TCR测序数据的肿瘤新生抗原筛选方法，综合运用生物技术与信息技术，开发肿瘤新生抗原智能化筛选技术，大幅提升免疫原性肿瘤新生抗原识别的特异性和灵敏度。