[发明专利]一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用

权利要求书

1.一种重组突变型Tn5转座酶，其特征在于，所述重组突变型Tn5转座酶构建方法包括：

（1）以原突变型Tn5转座酶基因为模板，进一步改造突变M56A与E345K两个位点，获得Tn5m核苷酸片段；

（2）将Tn5m核苷酸片段与EF或TRX1核苷酸片段通过重组反应，获得EF-Tn5m转座酶或TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段；

（3）所述EF-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述TRX1-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

步骤（1）所述改造突变M56A与E345K两个位点所需要的引物包括：

56A-F：5′-GGCAGCAAAGCCGCCCAGGAAGGCGCGTAT-3′；

56A-R：5′-ATACGCGCCTTCCTGGGCGGCTTTGCTGCC-3′；

345K-F：5′-CAGCGTATGGAAAAACCGGATAACCTG-3′；

345K-R：5′-CAGGTTATCCGGTTTTTCCATACGCTG-3′。

2.一种包含权利要求1所述重组突变型Tn5转座酶的核苷酸序列的载体，其特征在于，将所述EF-Tn5m转座酶、TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段利用同源重组分别克隆到表达载体pET30a中。

3.一种利用权利要求2所述载体表达制备重组突变型Tn5转座酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将表达载体转入C3013感受态细胞中，放入冰上孵育30 min，再热激60 s，随后冰上孵育5 min；加入200 μL LB液体培养基，放入摇床复苏30 min后，涂布于终浓度50 μg/mL卡那霉素固体培养基上，37℃过夜培养；第二天挑取单菌落进行测序验证；

（2）将含有正确目的序列的单菌落接种于10 mL LB液体培养基，37℃培养过夜，从中取1 mL 接种于100 mL LB液体培养基，扩大培养至OD600 = 0.5，加入终浓度0.25 mM的IPTG诱导重组突变型Tn5蛋白表达；诱导6 h后，用50 mL离心管收集菌体，用于蛋白纯化；

（3）向菌体中加入10 mL 结合缓冲液 ，随后于超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎，再加入50 μL PEI（Sigma，P3143）沉淀菌液中的DNA分子，在4℃ 12 ,000g条件下离心10 min取上层清液；将上清液加入到已经预先平衡好的亲和柱中，待上清液流尽后，分别用结合缓冲液和漂洗缓冲液洗涤一次，然后加入10 mL 洗脱液，待液体流出一个柱体积后，封闭亲和柱，放于4℃冰箱过夜，第二天释放蛋白溶液，获得重组突变型Tn5蛋白溶液；

（4）重组突变型Tn5转座酶装配：分别按摩尔比ME-A：ME-R = 1：1，ME-B：ME-R = 1：1进行混匀并退火形成Tn5 接头A和接头B，然后将接头A与接头B等体积比混合，得到Tn5接头AB；将步骤（3）所述重组突变型Tn5蛋白溶液进行超滤浓缩并用储存缓冲液置换，再按体积比1：0.5；1：1和1：2加入混合的Tn5接头AB，最后加入终浓度为50%的甘油，混合均匀，20℃孵育40 min；

所述储存缓冲液配方为：20 mM Tris-HCl pH 8.0；0.15 M NaCl；1 mM EDTA；

结合缓冲液配方为：10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 M NaCl；1 mM EDTA；10%甘油；0.1%Triton X-100；

漂洗缓冲液配方为：10 mM Tris-HCl pH 8.0；2 M NaCl；1 mM EDTA；10%甘油；0.1%Triton X-100；

洗脱液配方为：20 mM Tris-HCl pH 8 .0；0.5 M NaCl；1 mM EDTA；50 mM DTT。