[发明专利]一株猪DC细胞的传代细胞系及其建立方法与应用

说明书

本发明属于生物免疫学领域，具体涉及一株猪DC细胞的传代细胞系及其建立方法与应用，本发明利用猪血液中的单核细胞分化成树突状细胞，在传代过程中发现一细胞集落，经反复传代后，建成一猪树突状细胞系。通过研究传代细胞的生长、表面标志、吞噬和抗原递呈作用，发现其细胞系具有树突状细胞特性，并具有很好的刺激T细胞增殖、细胞因子分泌和激发CTL细胞毒作用。

技术领域

本发明属于生物免疫学领域，具体涉及一株猪DC细胞的传代细胞系及其建立方法与应用。

背景技术

树突状细胞(dendritic cell,DC)是重要的抗原提呈细胞及连接机体固有免疫和适应性免疫应答的桥梁细胞。DC细胞通过表面表达受体识别并吞噬病原体，参与抗原提呈，并发育成熟，同时分泌不同类型的细胞因子，决定T细胞分化方向，最终影响细胞免疫应答效应。

DC细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟的DC细胞具有较强的迁移能力，成熟DC细胞能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。一般从动物体内分离的原代细胞只能传代几次，无法长期传代。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明利用猪血液中的单核细胞分化成树突状细胞，在传代过程中发现一细胞集落，经反复传代后，建成一猪树突状细胞系。通过研究传代细胞的生长、表面标志、吞噬和抗原递呈作用，发现其细胞系具有树突状细胞特性，并具有很好的刺激T细胞增殖、细胞因子分泌和激发CTL细胞毒作用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一株猪DC细胞的传代细胞系的建立方法，具体包括以下步骤：

步骤S1：细胞培养；

步骤S2：细胞传代培养；

步骤S3：光学显微镜观察细胞生长状况；

步骤S4：解冻后细胞生长特性测试；

步骤S5：DC细胞形态观察；

步骤S6：DC细胞表型鉴定；

步骤S7：DC细胞分泌细胞因子检测；

步骤S8：DC细胞生长曲线测定；

步骤S9：DC细胞对甘露糖修饰纳米颗粒包裹的GFP蛋白的吞噬。

进一步地，所述步骤S1具体为：

(1)猪外周血分离单个核细胞：

①取新鲜EDTA抗凝全血，用等体积的稀释液或者PBS稀释全血；

②在离心管中加入适量分离液，当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL时，加入等体积分离液，但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰；

③在室温下，水平转子500-1000g，离心20-30min；

④离心后将出现明显的分层，最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，其间含有单个核细胞，离心管底部是红细胞与粒细胞；

⑤小心吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min；

⑥弃上清，用5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min；

⑦重复步骤⑥；

⑧弃上清，细胞重悬备用；