[发明专利]一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法

说明书

本发明公开了一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法。该方法采用一种特殊的孢子抹散丝，直接从香蕉枯萎病菌常规平板菌落中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉枯萎病菌菌株。单孢分离培养的实施操作步骤如下：1)香蕉枯萎病菌产孢菌落的准备；2)孢子抹散丝的制备；3)孢子抹散板的制备；4)分生孢子的抹散；5)镜检寻找单孢子；6)载有单孢子小方块的切取；7)单孢子分离菌株的形成。本发明具有如下优点：1)分离孢子用的关键器具简单易制，分离操作简单易行；2)分离工作耗工少耗时短；3)能显著提高香蕉枯萎病菌分离的工作效率及分离结果的可靠性。

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法。

背景技术

香蕉枯萎病是我国香蕉产业的一种重大病害，该病害由香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cubense)侵染引起。开展香蕉枯萎病菌的生物学研究是香蕉枯萎病防控的重要基础。而开展香蕉枯萎病菌生物学研究的前提，必需要拥有香蕉枯萎病菌材料。

香蕉枯萎病菌群体的遗传组成复杂，不同菌株的生物学特性及致病性往往存在较大差异。正常的研究通常需要取得遗传组成单一的香蕉枯萎病菌材料，或者说单克隆菌株材料。本领域一般认为由单一孢子生长形成的菌株材料属遗传组成单一的病菌材料。显然，香蕉枯萎病菌的常规研究，通常需要获得单孢分离菌株材料。

香蕉枯萎病菌的单孢分离方法，主要是采用常规的孢子稀释分离单孢子的方法、以及直接挑取单孢子的分离方法。

孢子稀释分离单孢子的方法，主要技术特征是，将产孢菌落的分生孢子洗涤到水介质中，对孢子悬浮液进行适度的稀释分散，再通过微量移液枪、或毛细管、或移植针等器具，将悬浮液中的孢子分开，挑取单个分生孢子进行培养。这类方法需要实施菌落洗涤、对洗涤获得的孢子液进行孢子定量、以及需要进行孢子稀释操作等过程，比较费工费时。

直接挑取单孢子的分离方法，主要技术特征是，采用挑孢针直接在显微镜下挑取单孢子。由于普通显微镜的成像是实物的反向成像，显微镜下操作动作也是反向的，因此该方法需要特殊的操作训练，或者说需要操作人员有较深厚的反向显微操作技术功底。

而且，由于香蕉枯萎病在常规条件下多产生小型分生孢子，该分生孢子比较微小，常规单孢分离操作过程容易受到琼脂平板中的非熔杂质的干扰和影响。

发明内容

本发明的目的是，提供一种分离培养获得香蕉枯萎病菌单孢菌株的单孢分离方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法，采用一种特殊的孢子抹散丝直接从香蕉枯萎病菌菌落中，将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉枯萎病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1.香蕉枯萎病菌产孢菌落的准备：将常规分离培养取得的香蕉枯萎病菌移植到常规培养基平板，常规培养获得香蕉枯萎病菌的产孢菌落。

2.孢子抹散丝的制备：取出10μl普通移液枪的枪头，将枪头的尖端放在火焰上灼烧，枪头尖端燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的枪头，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离香蕉枯萎病菌分生孢子使用的孢子抹散丝，该抹散丝包括滑动丝a、丝柄b部分。

3.孢子抹散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用。

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板。