[发明专利]一种香蕉炭疽病菌的分离方法

说明书

本发明公开了一种香蕉炭疽病菌的分离方法。该方法采用一种特制的孢子离散丝，直接从香蕉炭疽病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉炭疽病菌菌株。分离培养的实施操作步骤如下：1)香蕉炭疽病标样的准备；2)孢子离散丝的制备；3)孢子离散板的制备；4)分生孢子的离散；5)载有单孢子小方块的切取；6)单孢子分离菌株的形成。本发明具有如下优点：1)分离孢子用的关键器具简单易制，分离操作简单易行；2)分离与取得单孢菌株能一次到位；3)分离工作耗工少耗时短；4)能显著提高香蕉炭疽病菌分离的工作效率及分离结果的可靠性。

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种香蕉炭疽病菌的分离方法。

背景技术

香蕉炭疽病是我国香蕉产业的一种重大病害，该病害由香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)侵染引起。开展香蕉炭疽病菌的生物学研究是香蕉炭疽病防控的重要基础。而开展香蕉炭疽病菌生物学研究的前提，必需要拥有香蕉炭疽病菌材料。一般实验室往往需要从病害标样中分离获得香蕉炭疽病菌。

香蕉炭疽病菌群体的遗传组成复杂，不同菌株的生物学特性及致病性往往存在较大差异。正常的研究通常需要取得遗传组成单一的香蕉炭疽病菌材料，或者说单克隆菌株材料。本领域一般认为由单一孢子生长形成的菌株材料属遗传组成单一的病菌材料。因此香蕉炭疽病菌的分离菌株材料一般需要获得单孢分离菌株材料。

至今公开的香蕉炭疽病菌的分离方法，主要是常规的组织分离培养方法和分生孢子稀释分离培养方法。

组织分离培养方法的主要技术特征是，需要将带菌组织进行表面消毒，再将消毒后的组织块转移到培养基上培养。该方法容易被腐生杂菌污染，重要的是分离获得的纯培养菌一般不属于遗传组成单一的香蕉炭疽病菌。

分生孢子稀释分离培养方法主要技术特征是，将发病部位的分生孢子洗涤到水介质中，并对孢子悬浮液进行适度的稀释分散，再通过微量移液枪、或毛细管、或移植针等器具，将悬浮液中的孢子分开，挑取单个分生孢子进行培养。这类方法需要实施孢子液的孢子定量及稀释操作过程，比较费时费工，而且很容易出现杂菌污染而影响分离工作的效率与效果。

发明内容

本发明的目的是，提供一种分离培养获得遗传组成单一的香蕉炭疽病菌纯培养的分离方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种香蕉炭疽病菌的分离方法，采用一种特制的孢子离散丝，直接从香蕉炭疽病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉炭疽病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1.香蕉炭疽病标样的准备：将普通熟化处理的香蕉果实进行常规保湿培养，直至香蕉果上潜伏侵染的炭疽病发展成典型的病斑及孢子粘液，作为待分离病菌的香蕉炭疽病标样。

2.孢子离散丝的制备：取出1000μl普通移液枪的枪头，将枪头的尖端放在火焰上灼烧，枪头尖端燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的枪头，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离香蕉炭疽病菌分生孢子使用的孢子离散丝，该离散丝包括滑动丝a、丝柄b部分。

3.孢子离散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用。

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板。