[发明专利]一种番茄灰霉病菌的分离方法

权利要求书

1.一种番茄灰霉病菌（ Botrytis cinerea ） 的分离方法，其特征是，采用一种细软且兼有弹性的孢子拖散丝，直接从番茄灰霉病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的番茄灰霉病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1)番茄灰霉病标样的采集：在番茄种植季节，到田间采集典型的番茄灰霉病标样，带回实验室作为待分离番茄灰霉病菌的标样；

2)孢子拖散丝的烧制：取出1.5ml普通离心管，将离心管底端放在火焰上灼烧，离心管底端燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的离心管，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离番茄灰霉病菌分生孢子使用的孢子拖散丝，该拖散丝包括滑动丝(a1)、丝柄(a2)部分；用一截普通笔杆套牢于离心管内，增加丝柄(a2)的长度；

3)孢子拖散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用；

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板；

③孢子拖散板的切制与装片：用灭菌刀片将操作②制成的琼脂平板，切割成长条状的琼脂条块，该琼脂条块就是起分散孢子作用的拖散板；用灭菌刀片将该拖散板挑起装放到灭菌载玻片上，成为备待分散孢子用的拖散板(b1)；

4)分生孢子的拖散：将步骤2)制备的孢子拖散丝进行常规表面消毒和清洁，然后手执孢子拖散丝的丝柄(a2)，将滑动丝(a1)的端部在步骤1)准备的标样病斑表面霉层轻轻点触，粘附分生孢子，将粘有孢子的滑动丝(a1)转移到步骤3)准备的孢子拖散板(b1)的一端，并贴放于拖散板面上，沿着拖散板面拖动滑动丝(a1)，滑动丝(a1)在拖散板面的相对滑动，导致滑动丝(a1)上粘附的孢子脱开散落在拖散板面上；

5)单孢小方块的切取：将步骤4)得到的载有分生孢子的拖散板(b1)，置于显微镜下观察，沿着滑动丝(a1)的滑动轨迹寻找离散的孢子，找出单一出现的孢子，选择与左右相邻孢子间隔距离远的单一孢子，用灭菌刀片将该单一孢子左右的拖散板(b1)切断及移开，得到只载有唯一1个分生孢子的小方块；

6)单孢子分离菌株的形成：用刀片将步骤5)切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到番茄灰霉病菌的常规培养基上，常规培养，直到孢子萌发生长形成单孢子菌落；移植单孢子菌落的菌丝扩大繁殖，形成番茄灰霉病菌单孢子分离菌株。