[发明专利]一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组

权利要求书

1.一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组，其特征在于，包括检测人腺病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：

ADV-F：

5’-TAAGGCTAATGGCAATGGCGCAGGTGATAATGG-3’；

ADV-R：

5’-[Biotin]GGTTGTCAGATATTTCCACGTTGGTGGGGTTGT-3’；

ADV-P：

5’-[FAM]AGAAATTTCCTTTACTCCAATATTGCACTA[dSpacer]ACCTGCCAGACAAGCT[C3-spacer]-3’。

2.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组，其特征在于，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第31个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。

3.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。

4.如权利要求3所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、重组酶、UvsY蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶、核酸内切酶IV。

5.如权利要求4所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述重组酶是来自大肠杆菌的解旋蛋白RecA蛋白，它的功能是介导模板的解链以及实现模板和引物之间的链替换；所述UvsY蛋白是一种辅助蛋白，可以协助或增强重组酶活性，是来自T4或T6噬菌体等的重组蛋白；所述单链结合蛋白为来自大肠杆菌或T4噬菌体的GP32蛋白，可以局部结合被替换出来的同源DNA单链，避免其被核酸酶降解；所述DNA聚合酶是Bst聚合酶，具有链置换活性，但不耐高温，因此非常适合在常温恒温条件下反应；所述核酸内切酶IV可以识别并切割探针上的脱碱基位点(dSpacer)，产生新的羟基末端。

6.如权利要求5所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括下述组分：Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

7.如权利要求6所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述醋酸镁的终浓度为100mM；所述Tris的终浓度为50mM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/μL。

8.如权利要求7所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性质粒为含有ADV基因片段的重组质粒，用于ADV核酸检测的阳性对照。

9.如权利要求8所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应，所述试剂盒可以检测的样品为咽拭子、鼻咽拭子。

10.如权利要求9所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样本的DNA；

(2)设计用于ADV检测的引物对及探针；

(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；

(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有ADV；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有ADV。