[发明专利]农杆菌介导的红椿遗传转化方法

说明书

本发明涉及一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：以红椿的叶片为外植体，用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染所述外植体；将经过侵染的所述外植体接种于共培养培养基，共培养；对经过共培养的所述外植体进行诱导培养，诱导培养包括：愈伤组织的诱导培养、不定芽的诱导培养、芽的诱导培养、根的诱导培养；所述菌液中含有乙酰丁香酮，所述共培养培养基中含有乙酰丁香酮。采用本发明的方法，成功实现农杆菌介导的红椿遗传转化，并且遗传转化率保持在10％左右，采用本发明的方法重复性及稳定性好，适用于批量化育苗，有利于农业产业化发展。

技术领域

本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，涉及一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法。

背景技术

红椿(Toona ciliata)，为楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)阔叶树种。在我国，红椿 天然居群具有零星分布的特点，主要在华南、华中、华东及西南地区分布，因其材质好，色 泽艳丽，花纹美丽，芯材呈现生红褐色，红椿被冠有“中国桃花心木”之称，是优良的家具用材，被广泛应用在家具设计、车船制造及室内装饰领域；其树形美观，也可以作为行道树栽种；红椿也是近年来得到普遍关注的药用植物，红椿根茎叶都可以入药，枝叶提取物具有抗病毒、抗菌等生物活性，具有良好的药用功效；该树种具有早期生长迅速等特点，其生长量均超过一般人工栽培的常绿阔叶树种。因此，在我国南方地区，红椿已成为重点开发和利用的优质速生用材树种。

目前研究发现，在早期生长过程中，红椿极易遭到害虫取食危害，直接导致枝条中空、 断折，从而形成多头树甚至导致幼树死亡，这使得红椿难以成材，乃至成为红椿种植的致命 伤害。对红椿危害较大的害虫是麻楝蛀斑螟，若不能有效地解决麻楝蛀斑螟对红椿的侵害， 该树种则不能大范围推广，严重制约了该速生阔叶树种的可持续发展。同时，在部分林分试 验地中，红椿极易遭受反复冻害，使其无法正常生长。

通过遗传转化技术，将理想的基因转移到受体植物基因组中去，达到定向改良的目的， 为树木的育种提供了新途径。目前，随着相关基因的分离和鉴定及离体培养再生技术的进步， 通过遗传转化方法培育具有优良性状的新品种已经成为现实。随着转基因研究的不断深入， 所能改变的性状并不只局限于抗虫或者抗病，而且延伸到对环境胁迫的抗性等方面中。然而， 红椿作为木本植物，存在生长周期长、具有高度杂合性以及再生能力差等特点，使得遗传转 化具有一定困难和特殊性，而且红椿自身的生物学特性导致其在离体组织培养过程中存在难 以消毒彻底从而容易产生内生菌污染、外植体褐化难以克服等技术难题，这严重影响了红椿 遗传转化体系的成功构建，导致至今针对红椿的遗传转化体系的研究还尚未见报道。基于此， 目前还没有一套合适的遗传转化体系能用于将抗性基因等转入红椿从而达到推进红椿定向遗 传改良。

发明内容

基于此，有必要针对红椿遗传转化体系缺失的现状，本发明的主要目的是提供一种农杆 菌介导的红椿遗传转化方法，该方法实现了遗传转化技术在红椿中的成功应用并获得较高的 转化率。

本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：

一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：

以红椿的叶片为外植体，用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染所述外植体；

将经过侵染的所述外植体接种于共培养培养基，共培养；

对经过共培养的所述外植体进行诱导培养，诱导培养包括：愈伤组织的诱导培养、不定 芽的诱导培养、芽的诱导培养、根的诱导培养；

在其中一个实施例中，所述菌液中含有45mmol/L～155mmol/L的乙酰丁香酮，所述共培 养培养基中含有145mmol/L～155mmol/L的乙酰丁香酮。