[发明专利]一种不合成肠杆菌共同抗原和鞭毛的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种不合成肠杆菌共同抗原和鞭毛的基因工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明在大肠杆菌中敲除大肠杆菌基因组上ECA和鞭毛基因簇的62个基因得到突变菌WQM021，WQM022菌株在营养缺乏(M9)培养基中生长变快，菌体总量增多。采用本发明的方法，WQM022/pBHR68的DCW，PHB浓度和转化效率进一步提高，分别达到3.03g/L，78.95％，15.78％；重组菌株WQM022/pFW01‑thrA*BC‑rhtC；该菌株每小时L‑苏氨酸产量，葡萄糖转化效率和L‑苏氨酸产量分别达到1.83g/L，11.42％，0.63g/h。

技术领域

本发明涉及一种不合成肠杆菌共同抗原和鞭毛的基因工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

在所有肠杆菌科菌株中发现的肠杆菌共同抗原(ECA)存在三种不同的形式：甘油磷脂结合型、脂多糖核结合型和环型。ECA的生物合成和组装由一个基因簇编码。ECA具有保守的重复单元结构，由三个氨基糖组成：N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰-D-甘露糖醛酸和4-乙酰氨基-4,6-二脱氧-D-半乳糖。ECA在细胞膜完整性、鞭毛的生成、有机酸耐受性和细胞膜通透性等方面具有多种细胞功能。ECA也是一种毒力因子，在食品领域可能加速产品变质和病原菌群污染，增加医疗领域的治疗难度和感染风险。此外，ECA的生成可能会消耗细菌的能量和底物，这些能量和底物本应更好地用于促进细胞生长或代谢产物的产生。此外，位于外膜和周质间隙的ECA可阻碍物质交换和膜通透性，导致营养限制或工业发酵微生物生长缓慢。细菌鞭毛是另一种生物膜结构，既是运动细胞器，又是蛋白质输出/组装装置。鞭毛负责生物膜的形成、运动和趋化。此外，鞭毛介导的运动是导致发展中国家旅行者和儿童腹泻的一个关键毒性特征。

聚羟基丁酸酯(PHB)是一种广泛存在于微生物中的天然高分子生物材料。PHB在细胞内以不溶性球形包裹体或PHB颗粒的形式存在，作为生物体内的碳源和储能物质。PHB具有良好的生物相容性、生物降解性和热加工性，可作为生物医用材料和生物降解包装材料。据报道，截断脂多糖结构可以重新平衡碳和氮代谢，导致PHB的产量显著增加。目前，PHB的研究主要集中在生物合成途径的修饰、廉价原料的开发和利用以及PHB的再生和改性等方面。L-苏氨酸是一种必需氨基酸，广泛应用于医药、化学试剂、食品强化剂和饲料添加剂中。L-苏氨酸已通过微生物发酵工业化生产。L-苏氨酸的生物合成与TCA途径竞争，需要大量的能量来源，这是L-苏氨酸高产的瓶颈。L-苏氨酸的研究热点主要集中在代谢途径修饰上，如脂肪酸阻断、磷酸转移酶系统和底物再分配。

PHB和L-苏氨酸目前依然存在产量不高，生产工艺复杂，生产成本高的问题，如何解决这些问题，成为目前研究的热点和难点。

发明内容

技术问题：

本发明要解决的技术问题，是提供一种能够提高产物产量的底盘细胞的构建方法；同时提供一种能够提高产物产量的基因工程菌及其构建方法和应用。

技术方案

为了解决上述技术问题，发明人课题组考虑到ECA在大肠杆菌K-12亚群中不同领域的不良影响较多，MG1655菌株通过基因工程手段敲除所有12个参与ECA生物合成的基因，构建了ECA缺陷型WQM021，并随机选取了3种不同的产物：mCherry蛋白(蛋白质类)、PHB(碳源类)和L-苏氨酸(氨基酸类)，考察WQM021对发酵产品生产的促进作用。结果表明，去除ECA可以促进细胞在LB和M9培养基中的增长，促进PHB和L-苏氨酸的生产，并促进mCherry蛋白的生产和胞外分泌。最后，根据WQM021的代谢分析，鞭毛合成基因被进一步从WQM021中敲除，获得ECA和鞭毛双缺失的突变株WQM022。研究发现，WQM022可以合成更多的PHB和L-苏氨酸，并进一步促进mCherry蛋白的生产和胞外分泌。因此，WQM021和WQM022具有作为优秀的底盘菌株的应用潜力，同时也表明，通过去除微生物非必需的膜壁结构，不仅能减少致病性风险，还可以将节约的底物和能量用于发酵产物的合成，这对其他工业微生物的优化和转化具有特殊的指导意义。