[发明专利]一种枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备方法

说明书

本发明涉及一种枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备方法，包括如下步骤：芽孢菌种的活化处理，首先将菌种融化分散，然后取少量菌种悬液滴入至营养肉汤内，进行培养后直至得到第三代芽孢菌种悬液，芽孢菌种的繁殖，无菌吸取适量第三代芽孢菌种悬液，接种至营养琼脂培养基上，置于培养箱内繁殖数天，芽孢的诱导生长，采用低温诱导的方式作用于繁殖后的芽孢菌种，促进芽孢生长。本发明的整个过程操作简单，由原来的12天缩短至8天左右，明显提高了芽孢的制备效率，且经检测芽孢形成率达到了98%以上，得到了有效提升。

技术领域

本发明属于芽孢菌体制备技术领域，具体涉及一种枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备方法。

背景技术

枯草杆菌黑色变种芽孢，是枯草芽孢杆菌的一个亚种，非致病菌，单个或呈短链状排列，芽孢椭圆形，中生，不膨大。枯草杆菌黑色变种芽孢因能产生对热、紫外线、电离辐射和某些化学物质很强抗性的芽孢，可以作为消毒剂检测及灭菌质量控制方面的质量控制标准菌株进行应用，我国的《消毒技术规范》中将枯草杆菌黑色变种芽孢作为消毒灭菌指示微生物，并在《消毒技术规范》中记载有枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备时间为12天左右，在此过程中，待芽孢形成率达到95%以上才能进一步制备芽孢悬液，若未达到此数值，还应在室温内放置一段时间直至达到95%的芽孢形成率，因此该实验的芽孢形成率很难保证，且操作较为复杂，制备效率低且芽孢形成率不高，针对上述问题，本发明提供一种操作简单，能够提高制备效率和芽孢形成率的枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，而提供一种操作简单，能够提高制备效率和芽孢形成率的枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备方法。

本发明采用的技术方案为：一种枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备方法，包括如下步骤：

A：芽孢菌种的活化处理，首先将菌种融化分散，然后取少量菌种悬液滴入至营养肉汤内，进行培养后直至得到第三代芽孢菌种悬液；

B：芽孢菌种的繁殖，无菌吸取适量第三代芽孢菌种悬液，接种至营养琼脂培养基上，置于培养箱内繁殖数天；

C：芽孢的诱导生长，采用低温诱导的方式作用于繁殖后的芽孢菌种，促进芽孢生长。

优选的，所述步骤一中，进行培养得到第三代培养物的具体过程为，

a：取含有芽孢菌种的冻干管，在无菌操作下打开，使用毛细吸管吸取适量营养肉汤至冻干管中，轻柔吹吸数次，使芽孢菌种融化分散；

b：在冻干管中取10.0μl芽孢菌种悬液滴入至含有5.0～10.0ml营养肉汤的培养基试管中，培养后得到第一代芽孢菌种悬液；

c：取第一代芽孢菌种悬液，划线接种于营养琼脂平板培养基上，培养后得到第二代芽孢菌种悬液；

d：挑取第二代芽孢菌种悬液中的典型菌落，接种于营养琼脂斜面培养基上，培养后得到第三代芽孢菌种悬液。

优选的，所述第一、二、三代芽孢菌种悬液的培养条件均是将相对应的培养基置于37℃培养18～24h。

优选的，取第一代芽孢菌种悬液时，采用接种环进行沾取。

优选的，所述典型菌落为实际操作中面积较大、菌种较多的菌落。

优选的，所述步骤二中，芽孢菌种悬液的繁殖具体过程为，吸取第三代芽孢菌种悬液5ml，接种于含有营养琼脂培养基的罗氏瓶中并滴入至营养琼脂培养基的表面，摇动罗氏瓶使该芽孢悬液布满至培养基表面，然后将多余的菌液吸出，培养后得到大量繁殖的芽孢菌种悬液。

优选的，在吸取第三代芽孢菌种悬液时，在无菌环境中进行。

优选的，所述罗氏瓶内的芽孢悬液的培养条件是，将罗氏瓶置于37℃培养箱内培养3天。

优选的，所述步骤三中，低温诱导的方式为，从培养箱内取出繁殖数天的芽孢菌种，置于4℃冰箱中，培养2～3天。