[发明专利]一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法

权利要求书

1.一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将新采集的石斛鲜条洗净后进行脱水处理至恒重，粉碎、过40目筛，获石斛干粉；称取石斛干粉置于烧瓶中，向烧瓶中加入提取剂，在60℃下进行超声提取，然后重复离心提取三次，将三次离心的上清液合并，再置于60℃下减压浓缩至干，向减压浓缩得到的残渣加入0.1mol/L的HCl溶解后转移至10mL具塞试管中，再使用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，混匀，得到供试品储备液；

(2)柱前衍生化方法制备供试品溶液

移取2.0mL步骤(1)制得的供试品储备液于10.0mL具塞试管中，向具塞试管中加入14％三乙胺-乙睛溶液和1.2％异硫氰酸苯酯-乙睛溶液各1.0mL，混匀，室温避光静置30min，加入4.0mL正己烷，涡旋混合器振荡60s，静置10min，吸取下层溶液，即可得供试品溶液；

(3)构建HPLC色谱条件

流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为乙腈-水；

梯度洗脱条件为：0-3min、0％B；3-15min、0-12％B；15-20min、12-15％B；20-35min、15-25％B；35-40min、25-35％B；40-50min、35-65％B；

柱温为35℃；

流速为1.0mL/min；

检测波长为254nm；

(4)吸取步骤(2)中制得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪器并按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，以20种常见氨基酸中任意一种氨基酸为内标物，通过计算内标物氨基酸与其它氨基酸在HPLC图上的相对距离Δt_Ris，确定供试品溶液HPLC图谱中氨基酸的色谱峰，计算各氨基酸峰面积，通过内标物氨基酸与其它氨基酸的Δt_Ris值，鉴定HPLC图谱上的色谱峰所对应的氨基酸，并确定供试品溶液中内标物氨基酸具体为哪一种氨基酸，再根据内标物氨基酸与其他待测氨基酸的峰面积之比，计算出内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子f_s/i；

Δt_Ris计算方法如下：

Δt_Ris＝t_Ri-t_Rs

式中，t_Ri为测定的待测氨基酸在HPLC图谱上保留时间，t_Rs为测定的内标物氨基酸在HPLC图谱上保留时间；

(5)取步骤(4)中鉴定出的内标物氨基酸为对照氨基酸，将对照氨基酸用0.1mol/L盐酸溶于10.0mL容量瓶中，均匀混合，定容，得对照品储备液，然后按照步骤(2)的操作将对照品储备液进行柱前衍生化处理，得到对照品溶液；

(6)游离氨基酸含量测定

将得到的对照品溶液等比稀释成10个梯度，然后按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，获得内标物氨基酸标准曲线；将步骤(4)中计算出的供试品溶液中该内标物氨基酸峰面积代入曲线方程，计算出供试品溶液中该内标物氨基酸的浓度，然后按以下公式计算出供试品溶液中其它氨基酸的浓度：

C_i＝(C_s/A_s)×f_s/i×A_i

式中，A_s为供试品溶液中内标物氨基酸的峰面积，C_s为供试品溶液中内标物氨基酸的浓度，A_i为供试品溶液中其他待测氨基酸的峰面积，f_s/i为内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子。

2.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中石斛鲜条为石斛新鲜的茎，所述石斛包括霍山石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛及其近似种。

3.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中石斛鲜条的脱水处理为-50℃冷冻干燥。

4.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中提取剂为60％甲醇溶液，石斛干粉与提取剂的料液比为1:40/g:mL。