[发明专利]一株分泌苯海拉明单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

说明书

一株分泌苯海拉明单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于化妆品安全免疫检测领域。本发明分泌苯海拉明单克隆抗体的杂交瘤细胞株SHS 5B11，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCCNo.20787。此细胞株分泌的单克隆抗体，对苯海拉明具有较好的特异性和检测灵敏度。本发明合成了苯海拉明完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株SHS 5B11。此细胞株分泌的单克隆抗体，对苯海拉明具有较好的检测灵敏度(IC₅₀值为2.93ng/mL)，可以用于化妆品中苯海拉明的残留检测。

技术领域

本发明涉及一株分泌苯海拉明单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于化妆品安全免疫检测领域。

背景技术

苯海拉明是一种抗组胺药，被广泛应用于医药领域，对皮肤瘙痒、过敏性鼻炎、荨麻疹和接触性皮炎等过敏反应有良好效果。苯海拉明能起到杀菌、祛痘作用，并有一定的抗过敏效果，因此可能被添加于祛痘化妆品中以达到祛痘功效。由于化妆品所使用的原料或工艺流程中的丙二醇等物质能促进人体对苯海拉明的吸收，当人体内苯海拉明含量过高，会使中枢神经受到较强抑制，导致人体产生嗜睡、头晕、头痛、恶心、呕吐及上腹部不适等症状。我国《化妆品卫生规范》及欧盟化妆品法规明确规定苯海拉明为化妆品中的禁用物质。目前，苯海拉明检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，但也存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析苯海拉明残留物的方法。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在化妆品禁用物质分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测苯海拉明的前提是得到对苯海拉明具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对苯海拉明具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备苯海拉明单克隆抗体，但在制备能分泌苯海拉明单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备苯海拉明半抗原和苯海拉明完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出苯海拉明单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的苯海拉明单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是提供分泌苯海拉明单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的苯海拉明单克隆抗体对苯海拉明具有较好的检测灵敏度(IC₅₀值为2.93ng/mL)，可以用于建立苯海拉明的免疫学检测方法，检测化妆品中是否含有苯海拉明。

本发明的技术方案如下：一株分泌苯海拉明单克隆抗体的杂交瘤细胞株SHS5B11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20787。

本发明提供了上述一种分泌苯海拉明单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：

(1)制备苯海拉明半抗原及苯海拉明完全抗原，将获得的苯海拉明完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；

(2)将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；

(3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中苯海拉明抗体含量高的获得免疫的小鼠；

(4)将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的苯海拉明完全抗原进行；