[发明专利]一种N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法

说明书

本申请涉及农业生物技术领域，具体涉及一种N‑乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法。本发明通过截断糖酵解途径和磷酸戊糖途径对N‑乙酰氨基葡萄糖合成前体6‑磷酸果糖的分流，提高了突变型大肠杆菌底盘细胞中的产物前体供应，再利用游离的高拷贝质粒在底盘细胞内表达了N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径的关键酶，利用混合碳源培养基发酵生产N‑乙酰氨基葡萄糖，N‑乙酰氨基葡萄糖的产量达到2.8 g/L。

技术领域

本申请涉及农业生物技术领域，具体涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法。

背景技术

氨基葡萄糖是由葡萄糖分子的羟基被氨基所取代后的化合物。通常以N-乙酰基衍生物或N-硫酸酯和N-乙酰-3-O-乳酸醚形式存在于细胞壁结合多糖和动物结缔组织中。工业生产的氨基葡萄糖已被广泛应用于饲料、医药、食品、日化等诸多行业。其中，N-乙酰氨基葡萄糖能够修复人体受损软骨细胞组织，增加关节间的润滑，在医药领域尤其是治疗和预防关节炎方面发挥着重要作用。

目前，我国的N-乙酰氨基葡萄糖多以壳聚糖作为原料，通过水解反应进行生产。这不仅使原料来源受到很大限制，而且会造成体质敏感的人群发生过敏反应等。随着合成生物学的发展，生物合成N-乙酰氨基葡萄糖的方法已经被建立起来。但目前的发酵大多仅利用葡萄糖作为唯一碳源，存在产量低、转化效率低、副产物（乙酸、谷氨酸等）含量较高的缺陷。这不仅造成了因生产成本高而难以产生良好经济效益的工业生产困境，而且副产物的大量产生会使能源严重浪费并进一步造成环境污染。因此，建立一种能够在提升葡萄糖原料的转化率的同时能够将代谢副产物回收进行利用，从而避免能源浪费和环境污染，进而提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量的生产策略无疑极具吸引力。

发明内容

为解决现有N-乙酰氨基葡萄糖制备技术中存在的转化效率低、能源浪费等问题，本发明的目的是提供一种产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌。

本发明的再一目的是提供一种高效发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

根据本发明的产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌，所述工程菌为外源表达N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因和混合碳源共利用酶基因的敲除了糖酵解途径和磷酸戊糖途径中关键基因的突变型大肠杆菌，

其中，被敲除的糖酵解途径关键基因为ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1的编码基因pfkA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2的编码基因pfkB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，和磷酸戊糖途径关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，

所述N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因为Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶基因glms的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4，果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5， Caenorhabditis elegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6，

所述混合碳源共利用酶基因为Pichia pastoris来源的甘油激酶编码基因glpK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7。

根据本发明的构建产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌的方法，包括以下步骤：

敲除糖酵解途径和磷酸戊糖途径中关键基因，构建突变型大肠杆菌底盘细胞；

导入表达N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因和混合碳源共利用酶基因，