[发明专利]γ-聚谷氨酸在植物中异源合成提高植物抗逆性和产量的方法

权利要求书

1.γ-聚谷氨酸在玉米中异源合成提高玉米籽粒中的淀粉含量和直链淀粉含量的应用，其中应用步骤是：

(1) 克隆合成γ-聚谷氨酸的基因：从产γ-聚谷氨酸的菌株中克隆合成γ-PGA的3个关键酶基因PgsA、PgsB、PgsC；其中，基因PgsA的 GenBank ID: AIA08848.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；基因PgsB 的Genebank ID: AIA08846.1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；基因PgsC的Genebank ID: AIA08847.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述产γ-聚谷氨酸的菌株是地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）或解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；

（2）密码子优化：按照PgsA、PgsB、PgsC基因的氨基酸序列，通过玉米中的密码子偏好性分析，人工从头合成优化后的PgsA、PgsB、PgsC基因；其中，密码子优化后的PgsA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；密码子优化后的PgsB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；密码子优化后的PgsC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

（3）构建植物表达载体：将密码子优化后的PgsA、PgsB、PgsC基因连入含有bar基因筛选标记的植物表达载体pU130-bar，获得含有目的基因的植物表达载体，命名为植物表达载体PGA001，该植物表达载体PGA001的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

（4）获得玉米籽粒中的淀粉含量和直链淀粉含量提高的转基因玉米的方法是：

1）含植物表达载体PGA001的农杆菌菌株制备

选择EHA105农杆菌为转化菌株，在50μl该农杆菌感受态细胞中加入PGA001表达载体3μl，冰浴30分钟，液氮速冻5分钟，37℃水浴5分钟；再加入800-1000μl YEP液体培养基，25-28℃、180-250rpm振荡培养3小时；取出菌液涂布于含利福平及卡那霉素的固体YEP培养基上，置25-28℃黑暗倒置培养3-4天，取菌落进行菌落PCR验证，并进行测序，对测序正确的农杆菌保存，用于转化；

2）愈伤组织的准备

选取玉米自交系KN5585作为受体自交系，取其授粉后10-12d的果穗，去苞叶，在无菌工作台中，先用70%酒精处理5-6min，再用无菌水冲洗4-5遍，剥取1.5-2 mm的幼胚，盾片向上放置在幼胚诱导培养基上，28℃、黑暗培养诱导愈伤组织；2-3周后将诱导出的愈伤组织，选取生长速度较快、质地松软、松散易碎、颜色鲜艳的胚性愈伤组织转移到继代培养基上继代培养，每2周继代一次，用于农杆菌侵染；

3）农杆菌侵染

挑取含有PGA001表达载体的农杆菌单菌落，加入5-6mL的含Kan 的YEP培养基中，培养过夜；室温下，5000-6000rpm，离心5-10min，收集菌体；将菌体悬浮于含有乙酰丁香酮的侵染液中，并使OD₆₀₀=0.6-0.8，混匀，待用；将制得的侵染液在25-28℃，摇床180rpm活化1-2小时，用于侵染；将玉米的胚性愈伤组织收集在一起放入一个无菌的三角瓶中，然后倒入侵染液，将大的愈伤组织块打散摇匀，使愈伤组织充分接触农杆菌，侵染15-20min；将愈伤组织取出，在滤纸上吸干多余的菌液，然后接种到共培养培养基上19-22℃黑暗培养3天；

4）恢复培养

使用含有抗生素的无菌水冲洗愈伤组织表面3-5次，待加入的水不再浑浊时倒掉液体，将愈伤组织转入铺有滤纸的平皿中，在超净台中吹干愈伤表面水分，转入恢复培养基，28℃暗培养 7-10 天；

5）筛选培养

恢复培养后将转化愈伤组织转入添加有草铵膦的筛选培养基上，筛选培养两周，然后更换新的筛选培养基25-28℃暗培养 15-20天，将愈伤组织打散再转入新的筛选培养基继续筛选，总共筛选2轮，培养30-40天；

6）分化生根

将抗性愈伤组织转入分化培养基，25-28℃暗培养7-10天，然后转入光照培养箱25-28℃培养，直至再生芽长至3-5cm时转入生根培养基；

7）炼苗移栽后自交收种

待长出大量健壮根后，炼苗2-3天，洗净根部培养基后移栽在灭菌的营养土中，室内炼苗7天后移栽到大田；期间取其幼叶进行PAT/bar蛋白快速检测试纸条检测，转基因阳性玉米自交收获种子；获得T1代转基因玉米植株后，经过两代严格自交，最终获得转基因玉米纯合株系。