[发明专利]重组酿酒酵母菌株及其发酵方法

说明书

本发明涉及合成生物学领域，具体涉及重组酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)及其发酵方法。本发明确定了前体底物与甲基供体对整条异源路径的必要性，以及田麦角碱的异源合成路径对内源代谢产生了辅因子不平衡扰乱，为后续继续优化提产田麦角碱提供了有利证据。本发明的重组酿酒酵母菌株相对于现有报道的菌株产量显著提高。

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，特别涉及重组酿酒酵母菌株及其发酵方法。

背景技术

麦角生物碱主要是曲霉(Aspergillus)，麦角菌属(Claviceps)，以及内生真菌(Neotyphodium)这三类真菌的次生代谢产物，它是一类具有较强药理活性的真菌类吲哚类生物碱天然产物，是治疗偏头痛、子宫出血、帕金森症和其他疾病的治疗药物的原料。生物碱类药物通常从植物提取的起始原料中半合成，这往往限制了它们的可用性和最终价格。近年来合成生物学的进展使得将完整的植物途径引入微生物中来生产植物生物碱成为可能。

微生物生产改性生物碱具有加速生物碱类药物半合成的潜力，它提供了结构上更接近最终药物的高级中间体，可作为新型药物合成的高级中间体。几十年来，人们对麦角生物碱进行了深入的研究，主要是因为它们在受污染的食品和饲料中的有害作用，但也因为它们在医药和农业方面的有益应用。

麦角生物碱合成的源头底物为色氨酸和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)，尽管目前其生物合成路径中的共同前体可以确定为裸麦角碱，但是裸麦角碱的下游合成路径并不是十分清晰，具体的催化机理，反应机制不清楚。而涉及chanoclavine-I形成的一共需要四个酶，分别为dmaw和easF、EasE和EasC，dmaw和easF这两步酶不是限制chanoclavine-I形成的因素，关键是EasE和EasC的研究。2014年，CurtAF Nielsen等研究者成功地在酿酒酵母中以色氨酸和DMAPP合成了裸麦角碱，筛选到来自日本曲霉的EasE和EasC这两个蛋白实现了裸麦角碱的合成，使得EasE和EasC在酵母异源中表达成为可能，关键酶EasE和EasC的研究依赖于真菌的基因互补，但进一步的表征则受到EasE蛋白表达困难的阻碍。最终发现EasE的N端ER靶向信号肽对在酵母中表达活性有影响，研究者对EasE信号肽做了截短验证，并没有将其他酶共同作细胞器定位尝试。2015年，Dorota Jakubczyk等研究者在酿酒酵母中实现了从头合成cycloclavine，裸麦角碱的一步下游产物，通过增加了三个拷贝数的dmaw、四个拷贝数的easC实现了cycloclavine产量为529mg/L，裸麦角碱产量为0.75mg/L，平行副产物羊茅麦角碱89mg/L，发酵优化发现低温22℃对EasE和EasC催化速率有明显提高使得chanoclavine-I产量翻了十几倍。2010年，JohnathanZ.Cheng等研究者发现在麦角生物碱合成路径中EasA是一个重要的分支控制点，序列比对发现easA与黄素酶高度同源，EasA负责两个功能分别为异构化和还原性。2011年，Marco Matuschek等研究者通过在大肠杆菌中表达获得可溶性蛋白EasG，体外通过控制还原性谷胱甘肽(GSH)的量与NADPH，裸麦角碱醛混合孵育，最终获得田麦角碱。在麦角生物碱合成路径中GSH替代了EasA的作用，对此说明EasA的具体催化机理或者说裸麦角碱醛到田麦角碱的催化机制依然是不清楚的。2019年，YongpengYao等研究者又进一步解析了EasC的催化反应机制，EasC主要负责麦角生物碱中心碳环的生物合成，研究者提出自由基理论，解释了EasC的双功能——过氧化氢酶和单加氧酶功能。到目前为止，在异源宿主中进行合成田麦角碱的难度在于EasA酶的功能分配，还原性功能的表达将裸麦角碱醛流向羊茅麦角碱，已实现了89mg/L的滴度。

田麦角碱作为麦角生物碱合成路径上一个重要分支点走向的中间产物，对开发生物合成麦角酸衍生物系列占有举足轻重的地位，而在麦角生物碱中麦角酸衍生物是主要用于医药开发的一类，到目前为止在酿酒酵母中还未实现其全合成，因此田麦角碱的异源表达成功对下游麦角生物碱的研究具有十分重要意义。

发明内容