[发明专利]判断背景引入微生物序列的方法及其应用有效
申请号: | 202110466665.1 | 申请日: | 2021-04-28 |
公开(公告)号: | CN113270145B | 公开(公告)日: | 2022-05-06 |
发明(设计)人: | 许腾;何福生;李晓蕾;谢淑媚;王小锐;李永军;苏杭 | 申请(专利权)人: | 广州微远基因科技有限公司;广州微远医疗器械有限公司;广州微远医学检验实验室有限公司;深圳微远医疗科技有限公司;微远(深圳)医学研究中心有限公司 |
主分类号: | G16B30/10 | 分类号: | G16B30/10;G16B40/20;G16B40/30;G16B50/00 |
代理公司: | 广州新诺专利商标事务所有限公司 44100 | 代理人: | 李海恬 |
地址: | 510130 广东省广州市高新技术产业开发*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 判断 背景 引入 微生物 序列 方法 及其 应用 | ||
本发明涉及一种判断背景引入微生物序列的方法及其应用,属于生物信息分析技术领域。该方法包括以下步骤:确定背景微生物列表:取若干病原微生物阴性样本,将各微生物丰度的定量值A与核酸总量D进行相关性检验,呈负相关则判定为背景病原微生物;判断模型建立:分别取背景病原微生物的阴性对照样本集和阳性样本集,将背景病原微生物基因序列数据比对至该微生物的特征序列区域,计算丰度,建立判断模型;微生物特异性区域定量分析:获取待测样本中背景病原微生物基因序列数据,采用上述判断模型进行判断。该方法能够准确判断测序所得微生物序列是否为背景引入,且可降低批次假阳或者假阴问题,可广泛应用于病原微生物检测的数据分析中。
技术领域
本发明涉及生物信息分析技术领域,特别是涉及一种判断背景引入微生物序列的方法及其应用。
背景技术
病原宏基因组学(mNGS)是一种不依赖于培养,直接从临床标本提取核酸并检测病原体的高通量测序技术。与传统临床的实验室检测方法相比,病原mNGS是基于核酸水平对序列进行检测,可以突破不同病原体类型的局限性,无偏向性的全面覆盖数千种病原体,同时鉴定细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种类型病原微生物,病原mNGS已逐渐成为临床微生物鉴定领域的重要工具。
然而mNGS的准确性会受到污染物的影响——检测到样品中并不真正存在的DNA序列。 mNGS实验中有两种主要的污染物类型,它们是由不同的来源引起的,分别为外部污染和内部污染。外部污染是由被测样品外部引起的,潜在污染源包括研究对象或研究人员的身体,实验室环境等;其中最重要的是内部污染,来自于样品收集工具、提取核酸需要用到的实验耗材、文库构建需要用到的试剂等。
虽然,可以通过实验室技术来减少污染,例如紫外线辐射,“超纯化”和/或试剂的酶处理以及分离PCR前和PCR后区域。但是,即使是最佳的实验室方法也不能完全消除DNA污染。生产这些实验耗材或者试剂要用到工程菌,工程菌核酸残留是必不可免的问题,通过对耗材进行处理或者严格实验室控制的方法只能消除部分污染,控制污染的水平,去除效果有限。
实践中最常用的方法是通过计算的方法去除污染,大体分为两种类型:
一种是直接去掉背景微生物的方法,比如同时设置一批阴性空白对照,通过去掉在空白对照中常见的微生物序列来去除污染;或者根据mNGS高宿主率的特点,用背景污染的核酸占比与样品核酸比例成反比的特点来去除潜在的微生物。这类型的方法只能获得潜在的背景污染列表,使用一刀切的方法,直接去掉这些微生物。但是临床常见病原体,比如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠杆菌、粪肠球菌、粘质沙雷菌等,都是同时存在于核酸提取背景或者试剂背景中的微生物,并不能判断样品中该微生物究竟是背景污染还是来源于样品本身的。
另一种是方法是通过加入内参进行定量,去除相对丰度在阈值以下的微生物,该方法对于内参的要求较高,需要定量准确且复杂度高的一个内参集,操作较为复杂。但实际操作中,我们发现不同的样品类型由于需要的前处理步骤不同,什么时候加入内参是会对最终定量的结果有不同影响的,不同样品类型需要单独计算相应的阈值,另外该方法基于严格假定背景微生物的核酸是个稳定的常量,在实践操作中经常发现不同批次的实验耗材的背景污染还是会有波动的,因此容易出现批次假阳或者假阴问题。
发明内容
基于此,有必要针对上述问题,提供一种判断背景引入微生物序列的方法,能够准确判断测序所得微生物序列是否为背景引入,且可降低批次假阳或者假阴问题。
一种判断背景引入微生物序列的方法,包括以下步骤:
确定背景微生物列表:取若干病原微生物阴性对照样本,分别提取核酸并确定该样本核酸总量D,测序,通过比对获得其中微生物序列,根据比对序列数获得各微生物丰度的定量值A;分别将各微生物丰度的定量值A与核酸总量D进行相关性检验,当该微生物的丰度定量值A和样本核酸总量D呈负相关,判定为背景病原微生物,获得背景病原微生物列表;
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