[发明专利]重组禽流感亚单位疫苗及其制备方法

说明书

本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及重组禽流感亚单位疫苗及其制备方法。本发明通过保留H5亚型禽流感主要保护性抗原HA骨架中的头部结构，同时将疫苗H5的颈部区替换为经过结构生物学设计改造后的具有广谱免疫保护的流感HA颈部区，该颈部区在小鼠实验中证实可以保护不同H5的突变株并且对H7可提供广谱保护。

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及重组禽流感亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

流感病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科，是单股负链分节段的RNA病毒。根据核蛋 白(NP)和基质蛋白(M1)上抗原决定簇的不同，流感病毒可分为A、B、C、D四型，其中A型和B型可给人类的健康带来威胁，尤其是A型，每年因全球季节性流感和散发性流感而导致大约30万～50万人死亡，死亡率高达60％。按照流感病毒感染对象来说可将病毒分为人类 流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群。禽流感是由禽流感病毒引起 的一类人畜共患传染性疾病，属于甲型流感病毒，野生禽类是甲型流感病毒的天然宿主， 根据流感病毒对禽类的致病力不同，分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。禽流感 病毒(AIV)是由Perroncito(1878)于1878年在意大利首次报道的，此后又在世界上多个国家 和地区被陆续发现。

高致病力禽流感(HPAIV)已被国际兽疫局列为A类烈性传染病。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亚型。自 1905年禽流感病原被确认后，世界上暴发了多次由H5亚型、H7亚型引起的高致病力禽流感 (HPAIV)，并有研究发现在自然界广泛流行的低致病力毒株(LPAIV)的HA基因发生突变 后形成高致病力毒株，禽流感病毒通常对野禽不具有致病性，但跨物种传播时往往具有高 致病性。因此对于任何一种形式的禽流感，包括在水禽和野鸟体内持续存在，偶尔传播给 家禽导致低致病力禽流感的发生都是不容忽视的。

目前HA蛋白广泛应用于亚单位苗的研发中，已有研究表明，在细菌、昆虫细胞、哺乳 动物细胞等多种表达系统中表达的HA蛋白均有活性，利用HA蛋白研制基因工程疫苗在禽 流感防控中发挥着重要的作用。研究人员认为HA蛋白头部球状结构是禽流感主要的保护性 抗原。HA抗体滴度的高低从某种程度上能够反映机体对于禽流感病毒的抵抗力。随着基因 工程技术的飞速发展，研究人员将HA基因克隆至真核表达载体上，转化至真核生物或细胞 中进行表达来获得流感亚单位疫苗，进一步完成对动物免疫的研究。

范文辉等利用毕赤酵母表达系统表达纯化H5HA蛋白，将不同剂量的H5HA与不同佐剂 联用后免疫试验动物，进行免疫效力的评价。试验结果表明，H5HA具有较好的免疫原性，可诱导SPF鸡产生较高水平的IgG，血凝抑制效价达1：64，病毒中和抗体效价为1：218，研 究结果为H5亚型流感病毒亚单位疫苗的研制提供了理论支撑。周陈陈等人利用昆虫杆状病毒表达系统纯化的H7-HA蛋白免疫SPF鸡后进行攻毒保护试验，评价该蛋白作为免疫对SPF鸡的免疫保护效力，结果显示HA蛋白免疫组鸡只得到100％保护。研究表明以Sf9细胞表达的H-HA、L-HA重组蛋白配制成油乳剂疫苗免疫14日龄的SPF鸡。免疫后第14、21、28天 翅下静脉采血，通过血凝抑制试验(HI)和ELISA试验检测抗体效价，结果表明免疫后的 各组均能够刺激机体产生较高的抗体。在免疫后的第3、5、7、10天，经FCAS检测CD3+/CD4+ 和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群的变化规律和淋巴细胞转化试验。结果表明，2个重组蛋白组 鸡的CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群比例稍高于灭活疫苗组，淋巴细胞转化试验 亦表明，2个重组蛋白组鸡的淋巴细胞转化效率略高于常规灭活疫苗组。以上结果表明， 重组蛋白制备的疫苗能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，具有较好的免疫原性，综合 效果略优于现有H5亚型禽流感灭活疫苗。

但是，现有技术中的疫苗大多仅针对一种亚型，无法具有广谱性。通常具有多价疫苗 是将多种病毒灭活或对多个片段分别重组后制备的疫苗。其生产成本较高，生产周期也较 长。因此，进一步研发，生产成本低，能同时刺激机体产生针对多种亚型病毒的免疫力的禽流感疫苗具有重要意义。