[发明专利]ZmFhb1蛋白及其编码基因在提高玉米穗腐病抗性中的应用

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及ZmFhb1蛋白及其编码基因在提高玉米穗腐病抗性中的应用。本发明首次发现，通过抑制ZmFhb1蛋白的编码基因的表达，可以显著提高玉米对穗腐病的抗性。本发明所提供的sgRNA和CRISPR/Cas9敲除载体可以显著提高CRISPR/Cas9敲除载体的特异打靶效率，进而有利于提高玉米基因Fhb1基因的敲除效率。同时，按照本发明的方法可以快速创制抗穗腐病的玉米种质，进而能降低该病对玉米种植的影响。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及ZmFhb1蛋白及其编码基因在提高玉米穗腐病抗性中的应用。

背景技术

基因组编辑是一种对基因组进行定向精确修饰的技术，主要包括锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(TranscriptionActivator-Like Effector Nucleases，TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatednuclease，CRISPR/Cas)。CRISPR/Cas系统大致分为I型、II型和Ⅲ型3类，其中II型系统的组成比较简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA 3种成分即可发挥作用，且具有高效性和易操作性，成为目前应用最广泛的基因组编辑系统。II型CRISPR/Cas系统的特征蛋白为Cas9，Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个核酸酶结构域,该结构域负责切割靶DNA的两条链，从而造成靶DNA双链断裂。其中HNH结构域负责切割与crRNA互补的DNA链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif,PAM)上游3bp处，RuvC结构域则负责切割非互补链，切割位点位于PAM上游3–8bp处。Cas9蛋白同时具有加工产生crRNA以及切割外源核酸的功能。crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，研究者可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA(gRNA)或者将两者融合在一起形成单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)。sgRNA能够与Cas9核酸内切酶结合并将Cas9引导至基因组上对靶位点进行切割。CRISPR/Cas9系统使目标基因DNA产生双链断裂，激活细胞内的DNA损伤修复机制，进而产生缺失、敲入等变异。目前，CRISPR/Cas9系统已被迅速地用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得了较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。

玉米(Zea mays L.)是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品和化学工业的原料，在我国农业生产和经济发展中占有重要地位。玉米穗腐病又称赤霉病，是全球玉米种植区广泛发生的真菌性病害。目前，已报道的引起玉米穗腐病的病原多达20多种，包括禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、绿色木霉菌、串株镰刀菌、青霉菌(Penicillium spp.)、枝孢菌(Cladosporium spp.)等。上述病原即可侵染玉米果穗，也可以侵染籽粒，并可以产生有毒代谢产物如伏马毒素、黄曲霉毒素等，严重危害人、家畜、家禽的健康。其中，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、轮枝镰孢菌(Fusariumverticillioides)等病原既可以侵染玉米，也可以侵染小麦。玉米果穗发生穗腐病后，常出现粉红色、暗褐色或白色霉层，即病原菌的菌体、分生孢子梗和分生孢子，多雨或湿度大时可扩展到整个雌穗。病菌分生孢子借风雨传播，在15-28℃、相对湿度75％以上的条件下易侵染流行。发病籽粒无光泽，不饱满，质脆，内部空虚，百粒重显著降低。病菌在种子、病残体或土壤中越冬，成为第二年的侵染源。玉米籽粒在库存时，如果含水量偏高、库内温度升高，也会腐烂或发病。玉米穗腐病的防治要以选用抗病品种为基础，重要时期施药防虫防病。

发明内容