[发明专利]一种胰岛细胞的分离纯化方法

说明书

本发明涉及细胞分离技术领域，公开了一种胰岛细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：1)将灌注针的尾部与胰腺胰管的接口处进行缝合结扎，再通过灌注针将混合酶灌注入胰腺中；2)胰腺消化，收集胰腺组织液；在消化处理的过程中，进行取样，镜检和评估，评估达到收集条件：游离胰岛细胞的比例大于50％，开始收集胰腺组织液；3)将胰腺组织液进行离心，收集沉淀物加入纯化液、白蛋白，得到组织混悬液；4)将组织混悬液在约4℃的条件下进行梯度离心分离，收集胰岛细胞。本发明分离纯化方法通过减少灌注时间，把握收集胰腺组织液的最佳时机以及低温进行梯度离心分离，保护胰岛细胞的活率和形态，提高了最终胰岛细胞分离的数量、活率和纯度。

技术领域

本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及一种胰岛细胞的分离纯化方法。

背景技术

胰岛是胰腺的内分泌腺，其主要作用是感受体内的血糖水平并对其进行调节。胰岛在形态上是许多大小不等、形状不同的细胞团，其中主要的细胞类型包括α、β、δ、PP和ε等5种细胞。胰岛α细胞(约占24％～40％)分泌胰高血糖素促进体内血糖水平升高，而胰岛β细胞(约占60％～80％)分泌胰岛素来降低体内的血糖水平；胰岛δ细胞(约占6％～15％)分泌生长抑素，以负反馈作用的方式影响α细胞和β细胞的激素分泌，调控血糖平衡；胰岛PP细胞分泌胰多肽，胰岛ε细胞分泌饥饿激素。

1型糖尿病是由于胰岛细胞破坏、胰岛素分泌绝对不足引起的一种糖尿病，需终身使用胰岛素治疗。治疗糖尿病(尤其是1型糖尿病)最理想的方法是细胞疗法，即通过胰腺分离得到胰岛细胞，并进行相应的试验和治疗。细胞疗法中所采用的胰岛细胞来源于捐赠的人体或猪胰腺，通过供体的胰腺分离从而获得高质量的活体细胞。然而，目前的胰岛分离制备技术，得到的胰岛的产量、活率和纯度均较低。

发明内容

本发明目的在于提供一种胰岛细胞的分离纯化方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

为解决上述技术问题所采用的技术方案：

一种胰岛细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)获取供体的胰腺，将灌注针的尾部与胰腺胰管的接口处进行缝合结扎，再通过灌注针将混合酶灌注入胰腺中；供体选择为人供体。

2)将灌注后的胰腺分成多个胰腺块，将多个所述胰腺块和消化液混合后进行消化处理，收集胰腺组织液；在所述消化处理的过程中，每间隔一段时间进行取样，镜检和评估，评估达到收集条件后，开始收集胰腺组织液；所述收集条件包括：游离胰岛细胞的比例大于50％；

3)将所述胰腺组织液进行离心，收集沉淀物，将沉淀物加入纯化液中，再加入人血白蛋白进行混合，得到组织混悬液；

4)将所述组织混悬液加入密度梯度分离液中，在约4℃的条件下进行梯度离心分离，收集胰岛细胞。

优选地，步骤2)中，所述消化处理的具体过程为：将多个所述胰腺块放入消化装置里，再导入所述消化液，于32～38℃下进行消化，每间隔1～5分钟进行取样，对样品采用双硫腙进行染色，然后置于倒置显微镜下进行观察，评估达到收集条件后，结合观察消化罐中胰腺组织的消化程度，降低温度至20～30℃继续进行消化，并开始收集胰腺组织液，收集胰腺组织液和消化同时进行，待消化完全时，即可终止消化。

优选地，步骤2)中，所述收集条件为：组织在显微镜视野中的覆盖比例大于50％，胰岛细胞的数量大于45个以及胰岛细胞碎片的比例小于10％。

胰岛组织的数量和胰岛细胞的数量均为用显微镜观察样品得到的目测值，将样品聚到培养皿的中心，用倒置显微镜观察样品，来估算组织的数量及胰岛细胞的数目。

游离胰岛细胞的比例是指：游离胰岛细胞占胰岛细胞总数的比例；游离胰岛细胞是指只有不到25％的胰岛细胞边缘附着在腺泡组织上。