[发明专利]基于双立足点介导的链置换反应检测HBV的荧光传感器及其制备与应用

权利要求书

1.一种基于双立足点介导的链置换反应检测乙型肝炎病毒HBV的荧光传感器，其特征在于，基于靶物质触发的双立足点介导的链置换反应体系构建而成，所述链置换反应体系包括底物复合物、燃料链FS和靶物质T链，所述底物复合物包括底物链ST、带有荧光报告基团的辅助链AS和带有荧光淬灭集团的封闭链BK，将所述底物复合物加入到荧光传感系统中，靶物质可与底物复合物的双立足点结合，并通过立足点介导的链置换反应取代辅助链AS和封闭链BK，暴露出燃料链FS可识别的中间立足点区域；燃料链FS与暴露的中间立足点区域杂交置换出靶物质T链；置换出的靶物质结合其他底物复合物，触发下一个循环反应，从而产生大量的荧光信号，通过检测荧光信号即可获知靶物质的含量，实现HBV的检测；

所述底物链ST的核苷酸序列为：

5'-TT TTT TAC CGT CCC CAA GAA GAT CTG CCG T-3'(SEQ ID NO.1)；

所述辅助链AS的核苷酸序列为：

5'-TTG GGG ACG/i6FAMdT/TT TTT-3'(SEQ ID NO.2)；

所述封闭链BK的5'端带有荧光淬灭基团BHQ1，其核苷酸序列为：

5'-BHQ1-GCA GAT CTT C-3'(SEQ ID NO.3)；

所述燃料链FS的核苷酸序列为：

5'-TT TTT TTG GGG ACG GCA GAT CTT C-3'(SEQ ID NO.4)；

所述靶物质T链的核苷酸序列为：

5'-ACG GCA GAT GAA GAA GGG GAC GGT A-3'(SEQ ID NO.5)。

2.根据权利要求1所述的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备底物复合物：采用底物链ST、辅助链AS和封闭链BK，经变性退火制备三链产物底物复合物；

(2)取步骤(1)所得三链产物底物复合物，将其与燃料链FS、靶物质T链混合，孵育，构建链置换反应体系。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，底物链ST、辅助链AS和封闭链BK的摩尔比为1:1:1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将底物链ST、辅助链AS和封闭链BK分别溶解于TE缓冲液中，再混合于STE-Mg²⁺缓冲液中进行变性退火，所述TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl、pH8.0，1.0mM EDTA、pH8.0，所述STE-Mg²⁺缓冲液包括：10mMTris-HCl、pH8.0，1.0mM EDTA、pH8.0，150mM NaCl，12.5mM MgCl₂。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，变性温度为90-100℃，变性时间为5-10min。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将底物复合物、燃料链FS、靶物质T链溶解于STE-Mg²⁺缓冲溶液中，进行置换反应，所述STE-Mg²⁺缓冲液包括：10mM Tris-HCl、pH8.0，1.0mM EDTA、pH8.0，150mM NaCl，12.5mM MgCl₂。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，孵育温度为37℃，孵育时间为60-90min。

8.一种非疾病诊断或治疗目的的基于双立足点介导的链置换反应检测乙型肝炎病毒HBV的方法，采用权利要求1所述的荧光传感器和/或根据权利要求2-7任一项所述的方法制备得到的荧光传感器。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)荧光比色皿清洗：将荧光比色皿用酒精浸泡，并用ddH₂O清洗；

(2)设置参数：设置激发波长为490nm，发射波长范围为500-600nm，电压为600V；

(3)调零：向荧光比色皿中加入ddH₂O，进行调零；

(4)进行检测：将链置换反应体系加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。