[发明专利]一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法

说明书

本发明公开了微流控体外诊断技术领域内的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，包括以下步骤：将待测靶标的捕获抗体与表面羧基修饰的磁珠偶联；将待测靶标的检测抗体、过氧化氢酶和官能团活化的聚苯乙烯微球三者偶联；将偶联有捕获抗体的磁珠、偶联有过氧化氢酶与检测抗体的聚苯乙烯微球和待测靶标三者通过惯性蛇形微流控芯片混合；免疫反应后，磁分离洗涤，加入过氧化氢溶液与免疫复合物发生酶催化反应；再将反应液中剩余的过氧化氢与银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒混合，得到银‑磁纳米颗粒探针，以上反应同样在微流控芯片中进行；测量银‑磁纳米颗粒探针的横向弛豫时间变化值；使用本发明实现全血中痕量靶标的快速定量检测。

技术领域

本发明属于微流控体外诊断技术领域，特别涉及一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法。

背景技术

免疫分析一直是诊断疾病、环境监测和药物评估中不可代替的手段。对生物靶标进行免疫检测的手段主要有胶体金免疫层析、化学发光免疫分析法和酶联免疫吸附测定法，这些传统检测方法都很成熟，但也存在各自的缺陷。胶体金免疫层析法是将胶体金为标记物，对待测靶标进行检测的一种免疫层析技术，其步骤简便，试剂用量少，不需要辅助仪器，但存在灵敏度低、假阳率高和定量难等问题；化学发光免疫分析法利用分子吸收化学反应释放的能量后以光的形式辐射，根据信号强度确定待测靶标的能量，这种方法虽然灵敏度较高，但背景值高和稳定性差，样品的发光时间很短；酶联免疫吸附测定法通过检测待测靶标等吸光度来达到检测目的，具有较好的经济效益和稳定性等特点，但操作繁琐，且需多次洗涤，导致费时费力。更重要的是，以上免疫检测技术都是通过光信号读出，难以在临床上对全血样本检测。

随着微流控技术的飞速发展，芯片中的试剂存储，蛋白质吸附，样品分离和微流体流动特性以及方向控制的研究都很成熟，它已成为免疫检测和分析的重要工具。它可以将泵、阀和电子器件整合为一体，能解决上面检测中繁琐的处理程序，实现低成本、高通量、快速检测样本中的靶标。

基于核磁共振的磁弛豫时间传感器作为一种新型的检测传感技术，得到了广泛的关注。该方法通过磁性纳米颗粒分布的改变，使得水质子的横向弛豫时间(T₂)发生改变，其样本前处理简单，背景信号低，样本前处理简单，能够在全血中直接检测目标物。但现有技术中，基于磁弛豫时间传感器的传感方法依赖于抗体-抗原的免疫识别来改变磁性纳米颗粒的聚集状态，进而影响T₂信号值，此方法机理不足以检测痕量靶标，而且易受非特异性聚集的干扰，稳定性较差。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术中的不足之处，一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，解决了现有技术中无法检测痕量靶标的技术难题，本发明通过酶介导的催化反应来调控磁性纳米颗粒的聚集状态发生变化，实现T₂值的信号放大，可对痕量靶标进行检测，灵敏度高。

本发明的目的是这样实现的：一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，包括以下步骤：

(1)将待测靶标的捕获抗体与表面羧基修饰的磁珠反应，得到偶联有捕获抗体的磁珠；

(2)将待测靶标的检测抗体、过氧化氢酶和官能团活化的聚苯乙烯微球反应，得到检测抗体和酶修饰的聚苯乙烯微球偶联物；

(3)将氨水溶液滴加到硝酸银溶液中至澄清，加入氢氧化钾溶液，再滴加氨水溶液至澄清，然后加水溶液定容，最后加入磁性纳米颗，得到银氨溶液(Ag(NH₃)₂OH)稀释的磁性纳米颗粒；

(4)将偶联有捕获抗体的磁珠、偶联有过氧化氢酶与检测抗体的聚苯乙烯微球和待测靶标三者通过惯性蛇形微流控芯片混合，形成三明治免疫复合物；免疫反应一定时间后，检测芯片内的磁铁将富集磁性的免疫复合物，磁分离洗涤，分离掉不带磁性的颗粒；