[发明专利]一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法

说明书

本发明提供一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法。所述冻存液组合物包括：低级脂肪醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、ROCK抑制剂、原代细胞抗生素。冻存液按照终浓度的组成包括：低级脂肪醇，10‑50％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.01‑0.5g/ml；白蛋白，0.01‑0.2g/ml；ROCK抑制剂，0.1‑10μM；原代细胞抗生素，0.2‑20mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。类器官冻存方法包括：将培养得到的类器官去掉原培养基后加入细胞回收液反应5‑10min；在体系中进一步加入无菌Hank’s平衡盐溶液混匀，离心后保留沉淀；在沉淀中加入上述类器官冻存液后程序性降温。采用本发明的冻存液及方法对类器官进行冻存，在冻存复苏条件下能维持类器官原始细胞干性，有效保留类器官的冻存前的分化特征。

技术领域

本发明涉及类器官冻存技术领域，具体涉及一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法。

背景技术

类器官是一种体外培育而成的具备三维结构的细胞复合体。类器官与体内高度相似的遗传学背景及组织学特征，拥有类似真实器官的复杂结构，并能部分模拟来源组织器官的生理功能。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，类器官显示出巨大的应用前景。

类器官技术应用具有广泛前景，而类器官的冻存复苏是整个技术应用中的重要环节。类器官的冻存需要使用保护剂，防止细胞在冻存和复苏过程中受到冰晶损伤、脱水和吸水损伤。同时，与常规细胞冻存相比，类器官冻存除了需要维持细胞活性外，还要维持类器官部分结构和类器官的干性。常规细胞冻存方法常用的冻存液是二甲基亚砜(DMSO)加上胎牛血清(FBS)。然而，DMSO存在一定的毒性作用，会与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，并且具有血管毒性和肝肾毒性，存在潜在的致癌风险。FBS则成分复杂，存在多种影响类器官干性的生长因子或抑制剂，其含量如果控制不当会导致冻存复苏后的类器官丧失原有类器官细胞特性，影响冻存后的复苏成功率。因此，有必要开发适用于类器官的冻存液及冻存方法以提高类器官冻存的保存效果和冻存复苏的成功率。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种冻存液组合物，包括：低级脂肪醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、ROCK抑制剂、原代细胞抗生素。

进一步地，所述低级脂肪醇包括乙二醇、丙二醇、丙三醇中的至少一种。

进一步地，所述ROCK抑制剂包括Y-27632dihydrochloride、Thiazovivin、SB-772077B dihydrochloride、Y-33075、K-115、Azaindole1中的至少一种。

优选地，所述组合物包括：乙二醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、Y-33075、Primocin。

可选地，所述组合物还包括：海藻糖、不含维生素A的B27和儿茶素中的至少一种。

第二个方面，本发明提供一种类器官冻存液，按照终浓度的组成包括：低级脂肪醇，10-50％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.01-0.5g/ml；白蛋白，0.01-0.2g/ml；ROCK抑制剂，0.1-10μM；原代细胞抗生素，0.2-20mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。

优选地，所述类器官冻存液按照终浓度的组成包括：乙二醇，15-40％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.05-0.2g/ml；白蛋白，0.02-0.1g/ml；Y-33075，0.1-5μM；Primocin，0.5-5mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。

可选的，所述类器官冻存液按照终浓度的组成还包括：海藻糖，0.05-0.2g/ml、不含维生素A的B27，0.5-2×；儿茶素，0.001-0.01g/ml。