[发明专利]一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法

说明书

一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法，包括以下步骤：采用梯度稀释法从根际土壤样品或其他供试材料中分离获得细菌菌株，用划线纯化法对分离获得的菌株进行纯化，获得纯培养；采用点接法和平板对峙培养法相结合，将培养好的细菌菌种对植物病原菌进行初筛，以获得具有明显抑制效果的拮抗细菌；将初筛得到的拮抗菌株进行液体发酵培养，然后采用改良的平板对峙培养法和十字定位法，在特定的培养条件下对峙培养，测量菌落半径和抑菌带的大小；本发明操作简单，方法简便，极大减少了工作量，缩短了筛选拮抗菌的时间，提高了筛选效率，同时保证了筛选结果的准确性，与其他现有的方法相比省时省力且更准确。

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法。

背景技术

生物防治逐渐成为近年来田间病虫害防治的重要手段和研究热点之一，尤其是对于常见田间病害的防治，微生物菌剂的研究与应用成为热门。因此，从田间土壤或者其它供试材料中分离、纯化、筛选、鉴定出对供试病原菌具有较好拮抗作用的拮抗菌株是必不可少的步骤，但是从分离纯化，尤其是大量的筛选过程工作量之巨大，费时费力，往往还会产生一定的误差。

用于植物病害生物防治的生防因子有很多，其中以生防菌株的研究与应用最为广泛，效果最好。拮抗细菌在植物病害防治中发挥了非常重要的作用，筛选和应用拮抗细菌是当前植物病害防治领域研究的热点之一。其中，被开发作为生物农药的细菌菌株主要集中于芽孢杆菌（Bacillus sp.）和假单孢菌（Pseudomonas sp.)、土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）等，且对病原真菌、病原细菌、病原线虫都具有较好的拮抗效果，包括烟草、小麦、水稻、蔬菜、棉花、花卉等多种作物病害。

但是关于拮抗细菌的前期分离筛选工作量十分巨大，现有的筛选方法是平板对峙培养法，如KB药敏实验法（也叫滤纸片法），牛津杯法,改良的平板对峙培养法，高通量48孔细胞培养板法。定位的方法多是提前在培养皿上用记号笔标记，或者也有技术发明，如定位盘。工作费时费力，有时还会存在一定的误差，不够准确；定位盘的使用也不太方便，不能较好的解决问题。

公开号为CN103013884A的专利 “一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法”。该发明先将堆肥悬浮液涂布于平板后，再直接在平板上涂布致病菌菌液，使目标细菌与致病菌直接对峙，待形成抑菌圈后，从抑菌圈内将混合的目标细菌进行划线纯化，纯化后再挑取单个目标细菌进行平板对峙，从而筛选出拮抗细菌。一定程度上减少了分离筛选的工作量，但是后续挑取单个目标菌株可能不纯，纯化拮抗细菌也较为麻烦，甚至不容易得到具有较好抑制效果的原始目标菌株。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法，包括以下步骤：

（1）采用梯度稀释法从根际土壤样品或其他供试材料中分离获得细菌菌株，用划线纯化法对分离获得的菌株进行纯化，获得纯培养，并于4℃保存备用；

（2）采用点接法和平板对峙培养法相结合，将培养好的细菌菌种对植物病原菌进行初筛，以获得具有明显抑制效果的拮抗细菌；

（3）将初筛得到的拮抗菌株进行液体发酵培养，然后采用改良的平板对峙培养法和十字定位法，用移液枪吸取5μL发酵液，点在距离中心2.5 cm的对称四点的培养基上，中心位置接种植物病原真菌的5 mm菌柄，在特定的培养条件下对峙培养，测量菌落半径和抑菌带的大小，将最终筛选获得的拮抗细菌菌株保存在灭菌的50%甘油中，-80 ℃长久保存用。