[发明专利]激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法

权利要求书

1.激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法，其特征是包含以下步骤：

1)、预处理：

先用32目的标准筛分器对葡萄籽颗粒进行粒度分级，将满足上述分级条件的葡萄籽颗粒进行提取；

在提取葡萄籽油过程中的不同时刻进行取样，从而分别得不同时刻对应的葡萄籽颗粒；

2)、切片：

使用冷冻切片机在-20℃，切片厚度设置为50μm的条件下，将步骤1)所得到的提取过程中的葡萄籽颗粒从边缘向中心处进行冷冻切片，选择第一个切片作为外表区域切片，选择第3个切片作为浅表区域切片，选择第5个切片作为中心区域切片；

将外表区域切片、浅表区域切片、中心区域切片这3个葡萄籽切片分别放置于载玻片上；

3)、染色：

配制浓度为5±0.5ug/mL的尼罗红乙醇溶液；将步骤2)制得的3张带切片的载玻片放置于尼罗红乙醇染液中避光反应10±1min；

4)、观测油脂的三维空间分布：

将步骤3)所得的装有染色物料的载玻片放置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；根据所得图像，观测葡萄籽颗粒油脂的三维空间分布；

5)、油脂的荧光定量：

标记步骤4)所得的三维复合荧光图像的荧光，计算荧光面积比(FAF)，并计算获得油含量(SO_F)。

2.根据权利要求1所述的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法，其特征是：

所述步骤5)为：

使用Image J图像数据分析软件标记步骤4)得到的三维复合荧光图像200μm×150μm视野范围内的荧光，计算荧光面积比(FAF)；

利用下式来计算荧光法得到的油含量(SO_F)：

SO_F＝0.14FAF+0.1。

3.根据权利要求1或2所述的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法，其特征是：

所述步骤1)的加压提取包括超临界CO₂提取、CXE提取。

4.根据权利要求3所述的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法，其特征是：

所述步骤4)为：

将步骤3)所得的装有染色物料的载玻片放置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；分辨率设置为512×512分辨率，频率设置为400Hz，探测器负高压值设置为603；打开激光光源，选择XYZ三维扫描模式，使用莱卡激光扫描共聚焦显微镜图像处理软件处理样品图像；选择20倍水浸物镜或63倍水浸物镜，在连续扫描模式下获得2D图像，在最大强度模式下利用LAS-AF软件生成三维复合荧光图像。

5.根据权利要求4所述的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法，其特征是：

所述步骤3)中：取5mg尼罗红溶于5ml乙醇中，得到质量浓度为1mg/mL的尼罗红母液，将母液置于4℃避光保存；使用移液枪吸取尼罗红母液0.5ml，用乙醇定容至100ml容量瓶中，得到5ug/mL的尼罗红溶液，现配现用；将步骤2)制得的3张载玻片放置于尼罗红乙醇染液中避光反应10min。