[发明专利]一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法

权利要求书

1.一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.收集尿液，离心收集细胞并洗涤，然后重悬细胞；

S2.对步骤S1得到的悬浮细胞进行筛选，筛选得到含有CD9(-)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；

S3.对步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行扩增培养；

S4.将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤S3扩增培养后的肾前体细胞中；所述表达多能干细胞诱导因子的质粒为含有OCT4和SOX2基因的PEP4质粒以及含有miR 302-367基因的PCEP4质粒；

S5.将步骤S4转入质粒后的细胞在诱导培养基和人胚胎干细胞培养基中培养，得到修复型多能肾前体干细胞库；所述诱导培养基为含有5-AzadC、Kenpaullone、SB-431542、PD0325901和CHIR99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-AzadC的终浓度为1.5-2μmol/L，Kenpaullone的终浓度为2.5-3μmol/L，SB-431542的终浓度为0.5-0.6μmol/L、PD0325901的终浓度为0.8-1μmol/L，CHIR99021的终浓度为1.5-2μmol/L。

2.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S1中，收集尿液并在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用PBS溶液洗涤细胞，然后再次在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用PBS溶液重悬细胞，重悬细胞的PBS溶液加入量与细胞的体积比为(500-1000):1。

3.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S2中，采用标记了CD106抗体、CD140a抗体和CD140b抗体以及SOX9抗体的磁珠对细胞进行正筛选，同时采用标记了CD9抗体的磁珠对细胞进行负筛选。

4.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S3中，将步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％CO₂的条件下培养72-96h。

5.根据权利要求4所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：所述培养基为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基。

6.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S4中，采用电转染的方式将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤S3扩增培养后的肾前体细胞中；所述电转染的电压为200-300V，电击时间为200-300μs。

7.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S4中，在与表达多能干细胞诱导因子的质粒混合前，采用DPBS溶液洗涤步骤S3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的EDTA溶液对肾前体细胞进行消化，消化1-2min，再采用10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化；再在300-400g条件下离心3-4min，用DPBS溶液重悬细胞，使细胞密度控制在2-5×10⁶个/ml。

8.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤S5中，将转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养8-12d；然后在300-400g条件下离心3-4min，采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养15-18天，期间每天更换一次培养基。