[发明专利]一种新型高效微量检材核酸提取试剂、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提供一种新型高效微量检材核酸提取试剂，属于分子生物学领域，所述核酸提取试剂包括裂解液，所述裂解液包括有浓度1‑20mmol/L双功能螯合剂，所述双功能螯合剂同时具有金属螯合端和蛋白锚定端，所述双功能螯合剂为NOTA、MAA‑NOTA、p‑SCN‑Bn‑NOTA、p‑SCN‑NODA、MAA‑GA‑NODA、MAA‑DOTA、DOTA‑NHS、iEDTA或p‑SCN‑Bn‑DTPA；本发明通过在裂解液中加入同时具有金属螯合端和蛋白锚定端的双功能螯合剂，其可以作为连接中间体，将金属离子与不容易被吸附而留在溶液中的蛋白分子连接，从而有效地去除检材中的金属离子。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及磁珠法提取核酸领域，具体涉及一种新型高效微量检材核酸提取试剂、试剂盒及其使用方法。

背景技术

核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是最重要的生物信息分子和一切生物体的遗传物质。当前，以核酸为研究对象的生物技术，包括对核酸的提取、克隆、扩增、检测、测序等一系列技术飞速发展并广泛应用，而核酸研究的第一步，就是从各种生物样品中提取核酸，核酸提取的效率成为下游核酸研究能否成功的制约因素。由于核酸提取的重要地位，科学家开发了一系列核酸提取方法，包括用酚/氯仿等有机溶剂抽提的传统方法、操作简便但DNA纯度低的螯合树脂法、目前已经基本淘汰的玻璃粉吸附法、当前主流的硅胶膜吸附柱法、抗DNA单克隆抗体的免疫亲和法、自动化平台广泛应用的磁珠法核酸提取方法等等。

磁珠法核酸提取方法以超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠为载体，利用硅胶吸附DNA，先用细胞裂解液裂解细胞，通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸而在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理，从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中，在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒，再用纯水或TE洗脱吸附的DNA。磁珠法不需要离心，操作简单，而且在同一个反应管内提取，没有样品的损失，更适合于自动化提取。与chelex-100提取法相比，磁珠法回收率高，即使是0.5μl血仍能得到DNA分型，而用chelex-100提取同样量的血DNA有时不能得到分型。

检材中的DNA受阳光紫外线或者环境中的微生物核酸酶的作用下，DNA片段会降解成500bp以下的片段，并且存在大量的抑制剂，如单宁酸、血红素、蛋白酶、腐殖酸、金属离子等，导致后续PCR扩增困难；而现有的磁珠法核酸提取试剂盒只对有机类型的抑制剂有一定的去除效果，但对金属离子的去除效果不佳，而且忽略了在提取过程中对DNA片段的保护，从而不适用于降解检材。

发明内容

针对上述问题，本发明基于磁珠提取方法，提供一种新型高效微量检材核酸提取试剂、试剂盒及其使用方法，可以有效去除检材中的抑制剂，且对DNA片段在提取过程中能有效保护，防止进一步降解。

本发明的目的采用以下技术方案来实现：

一种新型高效微量检材核酸提取试剂，包括裂解液，所述裂解液包括有双功能螯合剂，所述双功能螯合剂同时具有金属螯合端和蛋白锚定端，所述双功能螯合剂为NOTA、MAA-NOTA、p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-NODA、MAA-GA-NODA、MAA-DOTA、DOTA-NHS、iEDTA或p-SCN-Bn-DTPA；其中，

所述NOTA为1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸；

所述MAA-NOTA为(2,2'-(7-(2-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；

所述p-SCN-Bn-NOTA为2-(4-异硫氰苯基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸；

所述p-SCN-NODA为1,4,7-三氮杂环辛烷-1,4-二乙酸-7-对异硫氰基苄基；