[发明专利]基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒

说明书

本发明提供了，基于RPA‑LbCas12a‑TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒，涉及沙门氏菌检测领域。基于重组酶聚合酶扩增技术与CRISPR基因检测技术相结合，通过优化改造的crRNA双靶点基因组合检测沙门氏菌，针对沙门氏菌的invA基因和fimY基因分别筛选和优化了crRNA，根据crRNA相匹配序列两端的核苷酸序列设计了RPA反应的上下游引物，得到引物组。根据该引物组、crRNA设计了RPA‑LbCas12a‑TTECDS体系，根据该体系建立了沙门氏菌的检测方法及试剂盒。本发明提供的检测方法和试剂盒用于实际样品的检测，具有特异性强、检测迅速、灵敏度高、精度高的优点。

技术领域

本发明涉及沙门氏菌检测领域，具体涉基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是食源性感染中最常见的病原体之一，对公众健康构成全球性挑战。轻症患者的主要临床表现是呕吐和腹泻，重症患者可能死于感染。准确、快速地检测沙门氏菌是预防大规模公共卫生事件的必要手段。常规培养方法需要对样本进行预增菌、选择性分离和生化鉴定。这种传统的检测方法既繁琐又耗时，需要2～3个工作日筛选疑似沙门氏菌菌落，然后进行1～2个工作日的生化检测。然而，它不能满足大量样本快速检测的要求，因此需要替代技术来快速、灵敏、准确地检测沙门氏菌。

目前已经报道了几种检测病原体核酸特征的方法，包括基于聚合酶链式反应(PCR) 的检测技术：定量实时PCR(qPCR)，基于等温扩增的检测方法：环介导等温扩增反应(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)；基于下一代测序的病原体诊断：宏基因组测序 (mNGS)。然而，这些技术既耗时又耗资，或者灵敏度和特异性都较低。因此，这些方法不能完全满足环境和食品样本中的现场检测和微量病原体的快速检测。

CRISPR-Cas系统包括一个用于靶点目标识别的向导RNA(crRNA)和一个Cas核酸酶，这种酶存在于细菌和古菌中，通过剪切外来核酸来免受病毒的侵袭。Cas蛋白家族中Cas9、Cas12、Cas13和Cas14可以识别DNA或者RNA产生侧链切割活性。在目标识别时，Cas核酸酶被激活，然后不加区分的切割旁边的单链DNA(ssDNA)。通过引入标记有荧光团和猝灭剂或荧光团和生物素的ssDNA报告分子，可以用荧光检测器或侧向流试纸条检测切割，同时通过PCR或其他等温扩增方法对目标DNA进行特异性扩增，来增加检测灵敏度。

对于沙门氏菌的检测，invA基因是一种入侵蛋白基因，编码一种建立沙门氏菌对肠黏膜细胞入侵能力的蛋白，该基因也是致病性沙门氏菌存在的最直接指标。另一个检测沙门氏菌的替代基因是fimY基因，据报道，该基因是沙门氏菌属特有的，调节1型菌毛的表达。此外，invA和fimY的氨基酸序列与GenBank数据库中已知的其他原核蛋白几乎没有同源性。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的缺陷，从而提供一种针对沙门氏菌的invA基因和fimY基因的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒，以提高沙门氏菌检测的特异性、灵敏度，达到快速检测的效果。

本发明提供了基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，包括crRNA和RPA引物对，所述RPA引物对包括：根据针对invA基因的crRNA3分子的核苷酸序列设计的RPA引物对，所述crRNA3分子的核苷酸序列如SEQNO.19所示；以及根据针对fimY基因的crRNA10分子的核苷酸序列设计的RPA引物对，所述crRNA10分子的核苷酸序列如SEQNO.26所示。

优选地，所述根据crRNA3分子的核苷酸序列设计的RPA上下游引物包括：上游引物的核苷酸序列如SEQNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQNO.4所示。

优选地，所述根据crRNA10分子的核苷酸序列设计的RPA上下游引物包括：上游引物的核苷酸序列如SEQNO.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQNO.8所示。