[发明专利]一种热稳定α-淀粉酶

说明书

本发明涉及一种热稳定α‑淀粉酶，通过从NCBI上获得α‑淀粉酶基因序列(α‑amyl ase，GenBank:KX216807.1)，易错PCR获得突变产物，将突变产物重组到毕赤酵母中获得表达，筛选热稳定性高的突变子，获得1个最适温度比突变型高20℃的突变子，其基因序列在第719、720位，由原来的AA分别突变为GG，有益效果在于，获得的突变α‑淀粉酶具有更高的最适反应温度，可以适用于高温环境。

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种热稳定α-淀粉酶。

背景技术

α-淀粉酶，即α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC.3.2.1.1)，α-淀粉酶随机作用于淀粉、糖原、寡糖或多聚糖分子内的α-1，4-糖苷键，并将淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖、低聚糖等小分子物质。淀粉酶是用途最广、产量最大的一类酶制剂品。工业用α-淀粉酶按微生物来源不同分为细菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶两大类。细菌α-淀粉酶水解淀粉的主要产物是糊精及少量寡糖和葡萄糖，真菌α-淀粉酶可以水解淀粉和麦芽三糖，终产物主要为麦芽糖和部分低聚寡糖及少量葡萄糖。麦芽糖因其优良的特性，广泛应用于医药工业、食品工业，由于真菌α-淀粉酶具有特殊的高麦芽糖生成能力，使其在很多工业上的应用逐年增加，例如高麦芽糖浆、烘焙和酿造工业等。目前大部分商用真菌α-淀粉酶在麦芽糖浆生产中的最适作用温度在50-55℃之间，但是目前真菌a-淀粉酶普遍存在热稳定性较差的问题。本发明通过大通量筛选获得了热稳定性提高的突变子。

发明内容

本发明的目的是提供一种热稳定α-淀粉酶，使得热稳定α-淀粉酶的最适作用温度有很大的提高，其具有更高的应用潜力和经济价值。

本发明的制备过程如下：

1.从NCBI上获得α-淀粉酶序列(α-amylase，GenBank：KX216807.1，Seq No.1)，交生物公司合成，设计PCR引物：5′-TATCGGAATTAATTCGGATCCATGAAGTCTTTCTTAAGTCTCCTTTGC-3′(Seq No.2)，5′-TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTTAGTTCTTTTGGAATATGGCAGG-3′(Seq No.3)，PCR反应结束后，加20μl Cloning Enh ancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用BamH I、Not I酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；

2.质粒DNA的提取

将携带有质粒pET20b(+)/α-amylase的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；

3.易错PCR扩增与突变文库的构建