[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌及其应用。所述重组枯草芽孢杆菌，将编码抗病毒多肽的基因与枯草芽孢杆菌中编码芽孢外壳蛋白的基因融合，在枯草芽孢杆菌中进行外源融合表达，获得能够在枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示所述抗病毒多肽的重组枯草芽孢杆菌，所述抗病毒多肽来源于猫冠状病毒，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明重组枯草芽孢杆菌产生的孢子采用经灌胃和滴鼻的途径免疫小鼠，能够在肠粘膜中激活强的粘膜免疫反应，以及小鼠体内的特异性和全身性免疫反应，且能够抵抗胃肠道的不良环境，有效定植，表明重组枯草芽孢杆菌的孢子是一种潜在的优良载体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

猫冠状病毒(Feline Cornavirus，FCoV)感染在猫中极其常见。目前还没有有效的治疗方法。基于FCoV尖峰蛋白的七肽重复序列2(HR2)设计合成的肽已被证明具有抗病毒作用(Liu，I.J.，et al.Peptides corresponding to the predicted heptad repeat2domain of the feline coronavirus spike protein are potent inhibitors ofviral infection.PLoS One 8(12)：e82081.2013)。

枯草芽孢杆菌是一种安全的益生菌，被广泛添加到食品、药物和饲料中。枯草芽孢杆菌孢子表面展示(Bacillus subtilis Spore Surface Display Technology，BSSD)技术被认为是表达具有高活性和稳定性的异源蛋白的最有前途的方法之一。外源抗原或蛋白质在枯草芽孢杆菌孢子表面的表达已经实践了十多年，并取得了显著的成功。

比如，公开号为CN102676570A的发明申请公开了一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体，载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有免疫球蛋白结合蛋白功能域编码基因。本发明还公开了含有该重组表达载体的重组枯草芽孢杆菌，其可以用于制备粘膜免疫佐剂，应用时，与抗原一起给药。本发明还提供了一种在哺乳动物中诱导对抗原的免疫应答的组合物，其至少包含一种抗原和一种有佐剂活性的重组芽孢。本发明用免疫球蛋白结合蛋白重组载体构建重组枯草芽孢杆菌口服疫苗的研究方案是“扬长避短”的一种新尝试，即通过芽孢直接展示免疫球蛋白结合蛋白与人源IgG-Fc段结合将融合人源IgG-Fc段的基因工程蛋白吸附在芽孢表面进行粘膜免疫。

然而，到目前为止，还没有相关研究在枯草芽孢杆菌芽孢表面进行表达展示猫冠状病毒相关的多肽。

发明内容

开发了一种抗病毒肽的重组枯草芽孢杆菌，这是一种针对猫冠状病毒的方便的接种策略。本研究以枯草芽孢杆菌芽孢外壳蛋白B(CotB)为载体，构建了一种在其芽孢表面表达FCoV HR2区域衍生肽的重组枯草芽孢杆菌，命名为rBS^CotB-HR2P。在小鼠模型中，通过灌胃和鼻内接种来评价用重组菌株免疫后产生的免疫应答能力。结果表明，重组菌株孢子可引起强烈的特异性粘膜和体液免疫反应。重组枯草芽孢杆菌可为开发新的安全的防控猫冠状病毒提供潜在的新应用途径。

常规可溶性抗原在口服免疫过程中，由于胃肠道耐受性差，容易降解而难以正常发挥作用，而枯草芽孢杆菌作为载体，可以顺利通过胃肠道屏障，并刺激一定的黏膜免疫反应，在运输方面也具有独特的优势，对恶劣条件耐受。此外，一般来说肌肉注射免疫可以引起良好的免疫反应，但这种接种途径会引发猫的不良应激反应。有报道表明，用于治疗艾滋病毒的抗病毒肽安夫维尔肽(T-20)在注射后出现了许多不良反应，如疼痛、硬结和红斑是最常见的临床症状。因此，将枯草芽孢杆菌作为一种有效的递送载体可能是解决FCoV感染的一种候选方案。

首次构建一株表面展示FCoV HR2抗病毒肽的重组枯草芽孢杆菌，该抗病毒肽的重组枯草芽孢杆菌创新性地使用滴鼻接种免疫，且在滴鼻免疫后可检测到特异性FCoV的IgG抗体和中和抗体。且抗病毒肽的重组枯草芽孢杆菌可在动物鼻腔或肠道中定植，可能为动物带来长久的保护。