[发明专利]一种检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器、其制备方法及其应用

权利要求书

1.一种检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器，其特征在于，所述双模传感器包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；

所述第一试剂为检测探针Probe 1，所述检测探针Probe 1为表面修饰捕获单链C的金纳米颗粒；

所述第二试剂为修饰有染料分子的发夹型DNA单链H2；

所述第三试剂为检测探针Probe 2；所述检测探针Probe 2为表面修饰有能识别目标核酸的发夹型DNA单链H1和内标拉曼分子4-MBA的金纳米颗粒；

所述捕获单链C碱基序列如SEQ ID NO：2所示：5’-SH-(CH₂)₆-TTT TTA ACA CAA ACATC-3’；

所述发夹型DNA单链H1的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，5’-ACA CAA CCC TAG TGG CGCCAT TGA TGT TTG TGT GAA TGG CGC CAC TAG GGT TTT T-(CH₂)₆-SH-3’；

所述发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；5’-ROX-GCC ATT CAC ACA AACATC AAT GGC GCC ACT AGG GTT GTG TCG CCA TTG ATG TTT GTG TT-ROX-3’；

所述金纳米颗粒（AuNP）粒径为15~100 nm；

目标miRNA-652的核酸碱基序列为：5’-AAT GGC GCC ACT AGG GTT GTG T-3’；

针对目标miRNA-652碱基序列的特异性实验对应的单碱基错配序列（SM），三碱基错配序列（TM），完全错配（UM）碱基序列为：

单碱基错配序列（SM）：5’-AAT GGC GCC ACT AGG GTT GAG T-3’；

三碱基错配序列（TM）：5’-AAA GGC GCC ACA AGG GTT GAG T-3’；

完全错配（UM）：5’-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A-3’。

2.权利要求1所述的检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）第一试剂的制备：

首先离心清洗AuNPs并使用超纯水重分散；

其次，将捕获单链C与TCEP溶液混合置于恒温混匀仪中过夜反应以还原巯基之间形成的二硫键；

随后将捕获单链C与AuNPs混合并共培养，捕获单链C通过巯基与金形成共价键修饰在AuNPs表面；

之后加盐老化，提纯去除上清液，得到终产物AuNP-C检测探针Probe 1，即为第一试剂；

2）第二试剂的制备：根据发夹型DNA单链H1设计并合成修饰有染料分子的发夹型DNA单链H2，即为第二试剂；

3）第三试剂的制备：首先，将发夹型DNA单链H1与TCEP溶液混合置于恒温混匀仪中过夜反应以还原巯基之间形成的二硫键；其次，将发夹型DNA单链H1与AuNPs混合并共培养过夜，然后加盐老化；随后，加入内标拉曼分子4-MBA共培养；最后，提纯去除上清液，得到最终产物AuNP-H1@4-MBA检测探针Probe 2，即为第三试剂；

4）SPR-SERS双模传感器的制备：

在检测疾病核酸标志物存在下，第三试剂上的H1被该核酸标志物触发打开，形成T-H1双链；

借助第二试剂，即染料分子标记的发夹型DNA单链H2，触发T-H1双链发生催化发夹自组装反应，在检测探针Probe 2表面形成多个染料分子标记的H1-H2双链，同时伴随疾病核酸标志物的释放，供循环使用；

在上述溶液中同时加入第一试剂和第二试剂后，第一试剂上的捕获单链C与H1-H2双链的粘性末端杂交，形成Probe 1-Probe 2网络结构，Probe 1-Probe 2网络结构的形成导致了DFM图的颜色变化和SERS信号增强；通过暗场显微镜观察到Probe 1-Probe 2网络结构在ITO玻璃上散射黄光或红光的DFM图；同时，SERS检测通过检测Probe 1-Probe 2网络结构中丰富的纳米间隙显著增强的染料分子 ROX和内标拉曼分子4-MBA的SERS信号来实现。