[发明专利]外泌体中核酸分子的检测方法

说明书

本发明涉及一种简便快速检测外泌体中核酸分子的方法，其包括裂解样品中的外泌体，用于释放外泌体核酸分子；逆转录反应，其中所述外泌体裂解后不经过提取核酸分子或经过提取核酸分子后进行所有RNA的逆转录反应，即RT‑For‑All，使外泌体中所有RNA在同一反应中同时进行逆转录；其中在所述逆转录反应中使用包含通用接头(例如，miRNA Adapter)和随机引物的逆转录缓冲液。本发明还提供了用于检测外泌体中核酸分子的试剂盒。本方法通过直接溶解外泌体释放内含成分，无需提取RNA和DNA，直接在同一个逆转录反应中进行所有RNA的逆转录。可从微量外泌体中检测出各种RNA和DNA。

技术领域

本发明涉及一种简便快速检测外泌体特性的方法，主要涉及外泌体内含物RNA及DNA的检测。

背景技术

外泌体(Exosomes)是一种大小约30-150nm的细胞外囊泡，具有脂质双层膜结构。早在1983年人们就在绵羊网织红细胞中发现了外泌体，但之后其一直被认为是细胞排泄废弃物的一种方式。随着近几年人们对外泌体的深入研究发现其携带大量蛋白、脂质、DNA和RNA(miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA)等重要信息，不仅参与细胞间通讯和信息交流，根据外泌体来源的细胞类型，其还在抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤修复等多方面起重要作用。

人体内几乎所有细胞在正常或病理状态下均可分泌外泌体，比如免疫细胞、内皮细胞、肿瘤细胞等。不同细胞来源的外泌体其所包含的活性物质功能特性也存在一定的差异，当外泌体由宿主细胞分泌并传递至受体细胞时，主要通过其所包含的活性物质调节或改变受体细胞的功能和生理状态。由于其稳定的物理性质和相对完善的数据支持等原因，其中外泌体RNA尤其是miRNA颇受关注。通过近几年的研究证实，外泌体miRNA与疾病有着非常紧密的关系，如参与免疫疾病、病毒感染、神经退行性疾病传播、癌症发生和转移等，并且可作为疾病诊断的生物标志物，因此，检测其内含物RNA，对于了解并研究外泌体的功能特性至关重要。

目前常用的对外泌体RNA或DNA的提取多为基于酚抽提或基于色谱柱的方法，此类方法不仅会造成部分RNA或DNA分子的丢失，直接影响后续结果分析，并且该方法相对复杂、耗时。特别是各种外泌体样品的量一般都很少，也不利于提取和定量RNA或DNA。

发明内容

鉴于以上，本发明的目的在于提供一种检测外泌体中核酸分子的方法，具体涉及一步法简便快速检测外泌体核酸分子的方法。本发明方法通过直接溶解外泌体使其释放内含成分，无需进行RNA和DNA提取，并且通过引物(即，通用接头和随机引物)和酶(即，逆转录酶和PolyA聚合酶)的含量的优化配比直接在同一个逆转录反应中进行所有RNA的逆转录。可从微量外泌体中检测出各种RNA和DNA。本检测方法可用于细胞培养上清液、血浆、尿或其它体液等样品中的外泌体RNA和DNA的快速检测。

具体地，本发明提供了以下技术方案：

1.外泌体中核酸分子的检测方法，其包括以下步骤：

裂解样品中的外泌体，用于释放外泌体核酸分子；优选地，所述样品为细胞培养液、血浆、尿液或其它体液样品；

逆转录反应，其中所述外泌体裂解后不经过提取核酸分子或经过提取核酸分子后进行所有RNA的逆转录反应，即RT-For-All，使外泌体中所有RNA在同一反应中同时进行逆转录；

其中在所述逆转录反应中使用包含通用接头(例如，miRNA Adapter)和随机引物的逆转录缓冲液；

优选地，在逆转录反应之后进行定量PCR或测序检测。

2.根据项目1所述的检测方法，其中，所述核酸分子包括RNA(例如mRNA、miRNA、lncRNA、cirRNA)和DNA(例如cDNA)。