[发明专利]一种快速专一检测2019新型冠状病毒的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种快速、专一的检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的试剂盒，其特征在于，包括工作标准品、恒温扩增反应液和阴性对照品。

所述工作标准品为包括2019新型冠状病毒(2019-nCoV)基因特异保守序列的阳性对照质粒，所述特异保守序列为SEQ ID No.1。

所述恒温扩增反应液中包括6条引物：外引物F3，其序列为SEQ ID No.2；外引物B3，其序列为SEQ ID No.3；内引物FIP，其序列为SEQ ID No.4；内引物BIP，其序列为SEQ IDNo.5；环引物LB，其序列为SEQ ID No.6；环引物LF，其序列为SEQ ID No.7。

所述阴性对照品为健康人的鼻咽拭子核酸提取液。

2.根据权利要求1所述的一种快速、专一检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒由特异保守序列对应的合成片段克隆至pGEM-T载体中构建而成，其浓度为10⁴copies/μL。

3.根据权利要求1所述的一种快速、专一检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增反应液的溶剂为双蒸水，所述恒温扩增反应液含有如下浓度的各溶质：8U/20μL Bst DNA聚合酶；1U/20μL AMV逆转录酶；8mM MgSO₄；2.4mM eachdNTPs；20mM KCl；20mM(NH₄)₂SO₄；40Mm Tris-HCl；0.2wt％TritonX-100；5pmol外引物F3；5pmol外引物B3；40pmol内引物FIP；40pmol内引物BIP；20pmol环引物LB；20pmol环引物LB；1.25×EvaGreen荧光染料。

4.一种使用如权利要求1至3任一项所述的快速、专一检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.待测口咽/鼻咽拭子样本提取的总核酸；

S2.取三支反应管，每个反应管均加入20μL所述恒温扩增反应液，然后在第一反应管中加入5μL待测样本核酸、在第二反应管中加入5μL工作标准品、在第三反应管中加入5μL阴性对照品，然后将三个反应管置于恒温扩增仪中进行扩增反应；

S3.扩增反应过程中实时测定三个反应反管中反应液的荧光值，待反应结束后对结果进行分析，以确定待测口咽/鼻咽拭子样本本中是否含有2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。

5.根据权利要求4所述的一种使用快速、专一检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的试剂盒的方法，其特征在于，扩增反应的反应温度为65℃，反应时间为30min。

6.根据权利要求4所述的一种使用快速、专一检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的试剂盒的方法，其特征在于，扩增反应的完成之后进行溶解曲线检测，该过程可以用来判断产物是否相对专一。