[发明专利]一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法

权利要求书

1.一种的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，其特征在于，所述柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法包括以下步骤：

步骤一，全面系统调查全区柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律；

步骤二，对柑橘(柠檬)轮斑病病原进行分离鉴定：观察菌落、分生孢子和分生孢子梗形态，分离菌株多个；在PDA培养基上20℃培养15天后，菌落致密，初期白色至灰色，后逐渐变蓝黑色，气生菌丝丰富，白色棉絮状，培养基背面奶黄色，并伴有黑褐色小点；显微镜分析分生孢子椭圆形、长椭圆形，向一侧略弯，顶端钝圆，基部略呈圆锥状，有明显的油球；培养基上不产生厚垣孢子和刚毛；培养2个月后，培养基表面或底部产生黑色的菌核；

步骤三，对柑橘轮斑病进行室内抗性鉴定：柠檬叶片背面针刺接种新鲜轮斑病菌丝块，10℃环境下保湿培养12-15天，柠檬叶片可明显发病，建立柑橘轮斑病室内接种方法；

步骤四，开展柑橘轮斑病遗传多样性分析和扩散流行风险性分析；

步骤五，进行轮斑病防治药剂的筛选试验：筛选咪鲜胺、多菌灵、苯醚甲环唑；咪鲜胺+矿物油复配，与多菌灵轮换使用，补充硫酸锌；

步骤六，创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术；建立10月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+0.3％硫酸锌，11月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+97％矿物油150-200倍液，12月初用25％多菌灵可湿性粉剂500倍+97％矿物油150-200倍液，1月初用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液喷施的用药方案，结合实施冬季清园、清除落果和病残枝、做好果园排水、根系复壮，及时剪除病部，搞好树冠修剪和微生态改良，实施营养诊断配方施肥增强树势，果实及时套袋，建立柑橘(柠檬)轮斑病绿色防控集成技术。

2.如权利要求1所述的柑橘轮斑病快速抗性的鉴定方法，其特征在于，步骤一中，所述全面系统对柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律进行调查，包括：

对柑橘轮斑病发生情况进行全面调查，初步摸清柑橘轮斑病发生情况和发病规律，包括发病面积、发病品种、发病率，以及发病与海拔、品种和管理的关系；其中，所述病害发生规律的确定，包括：

(1)调查柑橘轮斑病田间为害的时空分布、病状表现和病原越冬越夏病害侵染循环，初步明确田间发病流行规律；

(2)借助田间小气候观测仪，了解气候与病害发生的关系，确定最佳防治时期，指导田间防控。

3.如权利要求1所述的的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，其特征在于，步骤二中，所述对万州柑橘轮斑病病原进行分离鉴定，包括：

(1)现场考察柠檬轮斑病田间症状，发病初期叶片正面出现针头大小的红褐色小点，后病斑扩大呈圆形、椭圆形，直径1-13毫米，在叶脉处有拖尾，病斑边缘油渍状，发病后期叶片正面病斑中央产生呈轮纹状分布的黑色子实体。病斑散生，有时2-3个病斑可愈合成大斑。枝梢发病初期病斑呈红褐色小点，略微四陷；病斑逐渐扩大成圆形、椭圆形或梭形，褐色，木质部也变褐，后枝条逐渐萎蔫枯死；果实受害后病斑1-22毫米，2-3个病斑可愈合成大斑，病斑深褐色，深度凹陷，病斑不扩展到果肉，病斑中间后期会产生轮纹状排列的黑色子实体；

(2)采集疑似轮斑病的叶片、枝条和果实，进行室内病原菌分离，在PDA培养基上，通过组织培养法培养，用75％酒精消毒1分钟，然后用1％次氯酸钠消毒30秒，用灭菌超纯水冲洗3次，晾干，放入PDA培养基中，20℃培养7-14天即可获得目的菌落；病斑上有明显的子实体，则先用灭菌蒸馏水清洗叶病斑表面，然后用手术刀或针刮取病斑表面的子实体，用灭菌蒸馏水稀释后，用移液枪移至PDA上，20℃培养7-14天，待长出单个菌落后，挑取单个菌落至新鲜PDA培养基纯化培养；经显微镜观察分生孢子及分生孢子梗特点后，初步诊断为柑橘轮斑病，并在PDA斜面培养，保存于4℃备用；

(3)在分子鉴定上，设计特异性引物，建立稳定的分子鉴定技术，可以在室内快速检测柑橘轮斑病。