[发明专利]一种纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种纤维蛋白溶解酶，其特征在于，所述的纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述的纤维蛋白溶解酶的核苷酸编码序列为SEQ ID NO.2。本发明提供的纤维蛋白溶解酶制备方法简单，获得的酶活较高，体外溶栓率可达80%以上，体内溶栓能力也超出常用药物尿激酶和链激酶，同时也具有很好的体外抗凝效果，具有很好的临床应用前景。

技术领域

本发明属于蛋白酶制剂领域，具体涉及一种纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用。

背景技术

血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块，血管内血栓形成是心脑血管疾病发病的一个主要原因。在可变的流体依赖型(variable flowdependent patterns)中，血栓由不溶性纤维蛋白，沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。心血管内膜损伤、血流改变、血液性质改变都有可能造成血栓的形成。

目前针对血栓的治疗主要依靠抗血栓药，抗血栓药可分为抗凝血药、抗血小板聚集药和溶血栓药三大类，其中溶血栓药物可用于治疗急性血栓栓塞性疾病。第一代的溶栓药链激酶(SK）和尿激酶(UK）至今仍然是国内外使用最广泛的品种，其溶栓原理为凝血中形成的纤维蛋白，经纤维蛋白溶解酶作用从精氨酸-赖氨酸键上分解成可溶性产物，使血栓溶解。纤维蛋白溶解酶的研究对于开发新的溶栓药物十分必要。

中国专利200510094753.4中公开了一种纤维蛋白溶解酶生产菌及生产纤维蛋白溶解酶的方法。该发明从发酵食品虾酱中筛选出一种能生产具有溶血栓能力酶的菌株并提供了用该菌株生产纤维蛋白溶解酶的方法，其育种工作量小，费用低，安全性能可靠，可以进行液体发酵生产，成本低，可用于大规模生产。发酵产品无毒，可以直接制成胶囊、冲剂、口服液或口服含片，或作为功能性食品配料用于保健食品或普通食品中。其酶活可达588.4U/mL以上，有进一步优化的空间。

中国专利201110054330.5中公开了一种编码纤维蛋白溶解酶的cDNA序列和氨基酸序列及其应用。该发明以单环刺螠总RNA为模板，克隆得到了单环刺螠纤维蛋白溶解酶基因全长cDNA序列。由该纤维蛋白溶解酶基因的cDNA原始编码序列，翻译得到单环刺螠纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列。单环刺螠纤维蛋白溶解酶基因的cDNA序列，可以通过构建不同的重组质粒载体，构建如大肠杆菌或酵母菌等不同受体的纤维蛋白溶解酶基因工程菌，使之在基因工程菌中进行表达，从而制备纤维蛋白溶解酶。制备的纤维蛋白溶解酶可应用于制备治疗心脑血管疾病的抗凝血药物或溶解血栓药物，具有很好的研究开发前景。但其体内作用效果不明确，且分离纯化方法较为复杂。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种纤维蛋白溶解酶。本发明提供的纤维蛋白酶制备方法简单，得到的纤维蛋白酶酶活性高，且在体内和体外均有较好的溶栓效果，并有很好的体外抗凝效果。

一方面，本发明提供了一种纤维蛋白溶解酶。

所述的纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

所述的纤维蛋白溶解酶的核苷酸编码序列为SEQ ID NO.2。

所述的纤维蛋白溶解酶包括前导肽和成熟肽两部分。

所述的前导肽部分为SEQ ID NO.5。

另一方面，本发明提供了一种纤维蛋白溶解酶的制备方法。

所述的制备方法包括以下步骤：

（1）根据SEQ ID NO.2的序列进行包含前导肽和成熟肽部分扩增引物的设计并合成引物；

（2）提取蛹虫草RNA并进行反转录获得cDNA；

（3）以步骤（2）cDNA为模板，使用步骤（1）得到的引物进行扩增；

（4）将步骤（3）得到的扩增产物插入表达载体后转染细胞；