[发明专利]一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器

说明书

本发明公开了一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器。传感器的适配体DNA序列为：5'‑SH‑(CH₂)₆‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑‑MB‑3'，且DNA识别链的末端标记有电化学活性物质。本发明的一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器的适配体DNA引入了双识别的策略，双识别位点的适配体能更快速有效地特异性识别全血中的凝血酶，凝血酶的不同部位达到高的特异性，并且在DNA链的末端标记有电化学活性物质(亚甲基蓝)，从而将化学信号转化成电信号，实现对凝血酶的高灵敏、高选择性检测。

技术领域

本发明涉及电化学传感器技术领域，尤其涉及一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器。

背景技术

凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，是血管稳态的重要调节分子。凝血酶不仅能够调控凝血过程及伤口愈合，还是阿尔茨海默病、白血病以及血栓栓塞性疾病等病理过程的必需酶，在伤口愈合、血管止血、炎症、组织黏合、动脉硬化等过程中也发挥了重要作用。此外，凝血酶对肿瘤细胞的生长具有调节作用，浓度较低时促进生长，浓度较高时抑制其生长，甚至产生凋亡效应，在激活正常细胞的致瘤性和恶性细胞转移方面也扮演着重要角色。凝血酶含量是衡量机体凝血功能异常一种指标。因此，建立灵敏、快速的凝血酶检测方法具有重要意义。

适配体(aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolutionofligands by exponential enrichment，SELEX)，经体外筛选得到的结构化的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，与相应的靶标分子(蛋白质，病毒，细菌，细胞，重金属离子等)有严格的识别能力和高度的亲和力。近年来，基于适配体与传感器建立了一系列凝血酶检测方法，包括利用离子体共振原理的三明治结构传感器检测法、电化学发光生物测定法、比色法、荧光法、双重猝灭法等。这些方法具有一定的灵敏度，但存在传感器稳定性差、操作复杂、触发条件不可控等问题。因此，建立一种新的高灵敏、快速的凝血酶检测方法具有重要意义。

目前，凝血酶的适配体主要有2种(Apt15，Apt29)。一种含有15个特异性碱基(TBA15：GGTTGGTGTGGTTGG)的序列(图1a)，它与凝血酶的纤维蛋白原识别位点特异性结合，结合作用弱(Kd≈100nmol/L)，但抗凝作用强；另一种是含有29个特异性碱基(TBA29：AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT)的序列(图1b)，它与凝血酶的肝素识别位点相互作用,结合作用强(Kd≈0.5nmol/L)，但抗凝作用弱。虽然，Apt15与凝血酶的亲和力小于Apt29，但Apt15选择性更强。

电化学适配体传感器(Electrochemical aptamer-based,E-AB)能在未经处理的复杂样本体系中实现对特定活性分子的高精度测试，能更好地实时监测在活体内的药物。适配体主要依靠氢键，范德华力，疏水作用等分子间作用力形成独特的三维空间结构(如发夹结构，G四联体等结构)，这些高度结构化的核酸适配体能够紧密地结合靶标分子，从而可以实现高选择性地识别目标分子。MB氧化还原活性分子作为非常经典的信号分子，在生物传感器中的应用也十分广泛。基于适配体的电化学传感器(图2)检测原理是：测试时，氧化还原信号分子(这里为亚甲基蓝，MB)发生氧化还原反应，从而产生感应电流，当适配体与靶标物质结合时，适配体的构象发生改变，使得MB与电极表面的距离也随之变化，从而影响电子转移速率，使电流信号发生变化，最终，可通过电流的变化判断出靶标物质的浓度等信息。

所以构建了一种能与凝血酶分子进行高亲和力、高特异性地结合的DNA探针，应用于这一传感器平台，具有高选择性，高灵敏度并且快速地检测全血中的凝血酶，在疾病的早期诊断中具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种高灵敏的、快速的实现凝血酶检测的基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器。