[发明专利]DNA甲基转移酶Dnmt2在肝脏损伤修复中的作用

说明书

本发明公开了DNA甲基转移酶Dnmt2作为新的靶点在调控肝脏损伤修复及开发相关治疗药物中的用途。试验表明，动物敲除Dnmt2能加重肝脏损伤，升高丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，增加纤维化指标α‑Sma及Col1a1的表达，加重胆汁淤积，且在肝脏发生损伤后，Dnmt2蛋白会发生重新定位，由细胞核向细胞质转移。证明Dnmt2在动物肝脏损伤修复及再生中发挥十分重要的作用，可作为新的药物靶点，对治疗肝脏损伤的药物研发具有重要意义。

技术领域

本发明涉及DNA甲基转移酶Dnmt2的作用，尤其是在调控肝脏损伤修复中的作用。

背景技术

1.Dnmt2简介

生物体的遗传特征除了由基因序列决定，甲基化、磷酸化、乙酰化等也是能够改变基因遗传功能的方式。其中，甲基化是指在不改变基因序列的基础上，利用甲基转移酶将甲基从活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨，SAM)转移至蛋白质或核酸进行修饰，从而调节基因的表达和沉默，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容。

甲基化的的对象主要包括DNA、RNA、蛋白质，需要的酶也是三种不同的酶，分别是DNA甲基转移酶DNMT，RNA甲基转移酶(如METTL)与组蛋白甲基转移酶。其中，哺乳动物DNA甲基转移酶家族主要包括Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3A、Dnmt3B和Dnmt3L，Dnmt1的功能是维持DNA甲基化，Dnmt3的功能是参与DNA的从头甲基化，Dnmt2是其中最特殊的一个成员，它的DNA甲基化功能一直以来都存在争议，是否能够甲基化DNA还未得到确定的答案，但越来越多的研究都证明了Dnmt2具有甲基化RNA的功能，包括tRNA、micRNA，最近还证明了其能够甲基化mRNA。Dnmt2之所以被归类为DNA甲基转移酶，是由于其序列与细菌的DNA甲基化转移酶具有同源性，同时还因为人类的Dnmt2蛋白以及酵母的Pmt1甲基转移酶结构域与细菌DNA甲基转移酶结构域具有相似性。

1998年，Okano M等人发现在小鼠和人的细胞存在一个拥有甲基转移酶功能域的基因，并且和酵母的Pmt1基因具有很高的同源性，因此被命名为Dnmt2。在结构上，Dnmt2与DNA甲基转移酶家族其它成员有所不同：Dnmt基因由N末端结构域、C端催化功能域和靶结合域三个部分组成，N端结构域能够将酶靶向定位到细胞核和复制灶，但是Dnmt2缺少N端结构域，保留了催化功能域和靶结合域。同时Dnmt2还包含10个在原核生物和真核生物的DNA甲基转移酶中保守的序列，包括一致的S-腺苷-L-蛋氨酸结合基序和活性位点Pro-Cys二肽，也正是因为如此，Dnmt2被归入了DNA甲基转移酶家族。与此同时，Dnmt2也是该家族基因中最保守的成员，在几乎所有物种中都可以找到Dnmt2的同源物，不过值得注意的是Dnmt2缺乏确定的核酸结合位点，同时催化基序IV和其他部分催化中心的环也是无序的。

Dnmt2存在于原核生物和真核生物中，包括植物、真菌、寄生虫、昆虫和哺乳动物的基因组中，是在长期进化筛选压力下保留下来的基因之一，主要存在于肌肉、发育中的胚胎内脏、卵巢囊肿以及增殖中的睾丸细胞中。但是，正常情况下，Dnmt2蛋白的表达水平很低。在斑马鱼中，Dnmt2定位于细胞质，而在果蝇中则存在于胞浆和核内，定位显示大量的Dnmt2结合于核基质处。在小鼠细胞中观察Dnmt2的定位，发现内源性Dnmt2定位于细胞核，将GFP-Dnmt2转染鼠源或人源细胞后，发现其定位在细胞质，并且分布不均匀，在许多细胞中，GFP-Dnmt2会浓缩成胞质灶，且胞质灶随转染时间的延长而增加，表明了Dnmt2会发生核质穿梭。值得注意的是，Dnmt2的过表达会使细胞致死，在转染12h后，荧光信号会随转染时间增加而急剧减少。还有研究显示，EGFP-Dnmt2在细胞分裂S期弥散分布，但在有丝分裂开始后迅速定位于细胞核，在中期和后期，EGFP-Dnmt2形成纺锤状结构，并在核运动期间重新定位至中心体，在随后的S期中，EGFP-Dnmt2会分布至整个合胞体细胞质中，直到下一个有丝分裂期开始。

2.Dnmt2的功能

(1)甲基化功能