[发明专利]基于多重荧光定量PCR技术的新冠病毒突变序列检测技术及其应用

说明书

本发明提供一种基于多重荧光定量PCR技术的新冠病毒突变类型检测技术及其应用。本发明主要基于荧光定量PCR技术针对目前S基因重要突变类型，如序列位置23403，序列变化AG、序列位置23063，序列变化AT、序列位置22812‑22813，序列变化AGGA、序列位置23012，序列变化GA进行单管或多管多重检测。其试剂盒可以很好的鉴别目前流行的D614G、N501Y、K417N、E484K重要突变株且特异性好，对新冠病毒的突变监测具有十分积极的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及基于多重荧光定量PCR技术的新冠病毒核酸突变类型检测技术及其应用。

背景技术

自2019年12月起爆发的新型呼吸系统疾病，截止2021年1月中旬已在全球确诊超过九千万例，主要临床症状表现为发热、乏力、干咳。经分离鉴定，确认其病原为一种新型冠状病毒，国际病毒分类学委员会将其命名为“SARS-CoV-2”。这是目前在人体中发现的第七种冠状病毒，之前主要有6种，其中229E，OC43，NL63，HKU1四种致病性较轻，可引起轻微呼吸道疾病，其余两种SARS冠状病毒和MERS冠状病毒，可引起严重呼吸道疾病。

由于新冠肺炎疫情全球持续爆发以及RNA病毒更容易在复制过程中突变，新冠病毒突变位点不断出现，这对疫苗的预防效果和病毒监测都带来了一定的风险。目前多个新冠病毒突变株：谱系B.1.1.7(首先在英格兰发现)、B.1.351(首先在南非发现)和P1(首先在巴西发现)等，受到全球广泛关注。其中涉及S蛋白关键功能的D614G、N501Y、K417N、E484K关键突变尤为重要。针对新冠病毒检测阳性的病例，确认是否属于关键突变类型，对于病毒监测具有重要意义。

多种荧光定量PCR检测技术融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性、同一管多重或多管快速检测的优点，是目前临床检验中认同程度很高的一种检测技术，已广泛应用于科学研究和临床检测。但目前已上市产品中绝大多数为普通新冠病毒检测产品，涉及新冠病毒新突变类型技术极少。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于荧光定量PCR技术的新冠病毒核酸突变基因类型检测技术及其应用。

本发明一方面提供了一种用于检测新冠病毒核酸S基因突变类型的试剂盒，所述试剂盒包括以下引物和探针组中的任一种或几种，其中每组中的引物都包含正向引物和反向引物，每个所述探针的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团：

a.用于检测S基因突变类型：序列位置23403，序列变化AG的引物和探针；其中正向引物的核苷酸序列如：SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其中探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

b.用于检测S基因突变类型：序列位置23063，序列变化AT的引物和探针；其中正向引物的核苷酸序列如：SEQ ID No.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其中探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

c.用于检测S基因突变类型：序列位置22812-22813，序列变化AGGA的引物和探针；其中正向引物的核苷酸序列如：SEQ ID No.9所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示，其中探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

d.用于检测S基因突变类型：序列位置23012，序列变化GA的引物和探针；其中正向引物的核苷酸序列如：SEQ ID No.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其中探针的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

上述S基因序列的突变最终导致S蛋白中以下改变：序列位置23403，序列变化AG使得D614G；序列位置23063，序列变化AT使得N501Y；序列位置22812-22813，序列变化AGGA使得K417N；序列位置23012，序列变化GA使得E484K。