[发明专利]亚甲基四氢叶酸还原酶基因分型的引物、探针及检测方法

说明书

本发明提供一种用于亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因分型的LAMP引物组、SNP TaqMan探针及检测方法，依据MTHFR基因C677T突变位点设计LAMP引物组合以及SNP TaqMan特异检测荧光探针，对待测样品恒温孵育后进行熔解曲线分析，从而对MTHFR基因C677T突变位点类型进行分型。本发明还提出所述LAMP引物组合以及SNP TaqMan特异检测荧光探针在制备用于检测MTHFR基因C677T突变位点中的应用。

技术领域

本发明涉及基因突变位点检测技术领域，具体涉及一种用于亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因分型的LAMP引物组、SNP TaqMan探针及检测方法。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenete-trahydmfolate reductase, MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶，其催化与还原型辅酶I(NADPH)相关的5,10-二甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸。MTHFR的调控作用主要是DNA的合成、活化及修复。神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症可由MTHFR基因的缺陷导致。

基因多态性是指核苷酸序列上发生转换、颠倒、插入或缺失，其群体频率≥1％。MTHFR部分多态位点的错义突变可导致酶活性降低、缺失及热稳定性改变。其中C677T突变(rs1801133)是常见的主要突变位点，产生Ala222Val错义突变，主要引起酶活性改变。CC野生型突变成CT突变杂合型，MTHFR酶活性下降40％；突变成TT突变纯合型，MTHFR酶活性下降70％。MTHFR酶活性下降使体内5,10-亚甲基四氢叶酸 (5,10-MTHF)水平升高、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)水平下降，影响叶酸正常代谢。报道研究指出，叶酸及同型半胱氨酸代谢障碍、孤独症及新生儿缺陷、血栓形成倾向等疾病与MTHFR C677T多态性具有显著相关性。其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生儿缺陷最为严重。因此，MTHFR C677T基因多态性检测，可以提高临床治疗的针对性和可预见性。

目前，MTHFR C677T多态性基因分型分析大多采用Sanger测序法和荧光PCR法。Sanger测序法则测序周期长，通量较低，需要昂贵的设备和复杂的操作，不适用于大规模筛查或快速给出诊断结果，难以大规模推广。荧光PCR法检测时间长。

环式等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是针对目标DNA链上的6个区段设计4个(或6个)不同的引物，利用链置换聚合酶在一定温度下(60～65℃)进行引物置换反应，同时聚合dNTP进行产物延伸。LAMP具有高度的特异性，且扩增效率极高，可在 15～60min内实现10⁹～10¹⁰倍的扩增。LAMP扩增结果的检测，通常是添加染料，检测对应的荧光。由于LAMP具有等温扩增、不需要特定PCR仪器、反应时间短等优点，已广泛用于病原微生物、食品安全检测领域。由于一般LAMP使用的染料通常为SYBR Green或SYTO-9等，用于人基因如MTHFR C677T的检测，就需要分两管对同一样本进行检测，一管检测 C，另一管检测T，才能进行多态性基因分型。虽然时间缩短了，但是工作量增加。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供一种MTHFR C677T突变位点的检测方法，所述方法能够实现一管检测MTHFR C677T突变位点的野生型、纯合突变型和杂合型中的任意一种。本专利使用SNP TaqMan探针代替染料，可实现一管即可对样本进行多态性基因分型。基本原理是LAMP扩增之后的产物为环型产物，环为单链。设计LAMP引物时，使MTHFR C677T突变位点位于单链环上。针对此环上的MTHFR C677T突变位点设计SNP TaqMan探针。扩增后，进行熔解曲线分析。利用熔解曲线检测MTHFR C677T突变位点主要原理是在低温下，SNP TaqMan探针会同时与677位点的C或T所在序列进行退火，随着温度的升高，677位点的C或T所在序列与SNP TaqMan探针的变性温度不同，根据温度即可进行多态性基因分型。