[发明专利]一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物、方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物、方法和试剂盒，检测方法包括如下步骤：A、与人先天性肾上腺皮质增生疾病发病显著相关基因CYP21A2和HSD3B2的目的片段的扩增；B、体系配制；C、反应；D、DNA序列测序鉴定，本发明通过检测致病基因CYP21A2和HSD3B2的基因变异来辅助先天性肾上腺皮质增生疾病的筛查，具有可靠的特异性。在大约95％的情况下，肾上腺皮质带状区的21‑羟化作用受损，检测方法具有可重复性。

技术领域

本发明涉及分子生物技术和分子标记技术领域，具体为一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物、方法和试剂盒。

背景技术

先天性肾上腺皮质增生(CAH)是由一种或多种皮质醇生物合成酶的缺乏引起的，21羟化酶缺乏症(21-hydroxylase deficiency,21-OHD)是先天性肾上腺皮质增生症中最常见的类型，文献报道占CAH的90％～95％，遗传方式为常染色体隐性遗传。临床表现有男性化和失盐，出现低血钠、高血钾、循环衰竭、失盐危象,可发生于生后数周内，危及生命。根据临床表现的严重程度分为典型和非典型。典型包括失盐型、单纯男性化；非经典型也称为迟发型21-羟化酶缺陷症，患者只有轻度雄激素过多的临床表现。女性患者在出生时外生殖器正常或轻度阴蒂肥大，没有外生殖器两性畸形。最常见的症状为儿童阴毛提早出现，或年轻女性中表现为严重囊性痤疮、多毛症、多囊卵巢、月经稀发甚至闭经。非经典型21-羟化酶缺陷症女性患者也存在生育能力下降，程度比经典型患者轻。对于21-OHD的基因突变研究，近年来国内外报道逐渐增多，新的突变不断被发现。目前已经报道的突变位点达200个以上，其中，10个常见突变位点见于90％患儿。

CYP21A2基因编码酶的细胞色素P450超家族的成员。细胞色素P450蛋白是单加氧酶，可涉及催化药物和胆固醇代谢，类固醇和其他脂质合成的许多反应。该蛋白定位于内质网并在21位羟基化类固醇。它的活性是合成包括皮质醇和醛固酮在内的类固醇激素所必需的。该基因的突变会导致先天性肾上腺增生。一个相关的假基因位于该基因附近。涉及功能基因和假基因的基因转化事件被认为是类固醇21-羟化酶缺乏的许多原因。

HSD3B2基因编码的蛋白质是一种双功能酶，可催化delta(5)-ene-3-beta-hydroxy steroids的氧化转化和ketosteroids的氧化转化。它在所有激素类固醇的生物合成中都起着至关重要的作用。该基因主要在肾上腺和性腺中表达。该基因的突变与II型3-β-羟类固醇脱氢酶缺乏有关。

CYP21A2和HSD3B2基因的突变是导致先天性肾上腺皮质增生的原因之一，基因诊断也成为目前确诊先天性肾上腺皮质增生的重要手段。然而目前公认的先天性肾上腺皮质增生致病基因变异仅针对的是已发现的热点突变，仍有部分变异未作为先天性肾上腺皮质增生防控或治疗的靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物、方法和试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的方法，包括以下步骤：

A、与人先天性肾上腺皮质增生疾病发病显著相关基因CYP21A2和HSD3B2的目的片段的扩增；

B、体系配制；

C、反应；

D、DNA序列测序鉴定。

优选的，所述步骤B中体系配制具体如下：

优选的，所述步骤C中反应程序为：

1)变性的条件，95℃5min；

2)退火的条件，(首先95℃30sec，其次59℃30sec，然后72℃30sec)×25个循环；