[发明专利]经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及病毒复制中的应用

说明书

本发明公开了经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及病毒复制中的应用。所述的经过反密码子编辑的tRNA携带正常氨基酸，同时能够识别所述的提前终止密码子，并将携带的氨基酸插入到相应的位置，从而使得蛋白以及复制缺陷型病毒能够在该tRNA存在下完成表达及复制。该方法并不依赖特殊的氨酰tRNA合成酶以及UAA。仅对tRNA的反密码子编码序列进行突变改造就可以实现携带正常氨基酸的tRNA识别终止密码子并将携带的氨基酸插入到相应的位置，从而实现对蛋白表达以及复制缺陷型病毒精准调控，提高疫苗的安全性。本发明提供了一种用于蛋白或病毒精准控制的新方法，特别是在新型的复制缺陷型病毒疫苗的生产中将具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及经过反密码子编辑的tRNA的新用途，特别涉及经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及复制缺陷型病毒复制中的应用，本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

病原微生物引起机体的疾病对人类以及动物健康造成了巨大的影响，制造安全有效的疫苗是控制病原微生物感染的优先选择。然而，疫苗的安全性以及有效性很难兼得。如果给病原微生物安装精确调控其复制的“分子开关”，使其在体外复制可控，在体内不能复制，但是可以同时激活细胞免疫反应与体液免疫反应，从而使疫苗更安全。这种形式的疫苗代表了一种奇妙的疫苗的中间形式，即在灭活疫苗(安全但免疫原性低)和弱毒疫苗(免疫原性好但不安全)之间的新型疫苗。

精准调控病毒复制的分子开关使上述设想成为可能，在本发明之前，密码子拓展技术的出现使满足上述要求的疫苗成为可能，该技术结合病毒的基因组已经用于复制缺陷型病毒疫苗的研究。在该种病毒生产过程中，琥珀密码子(UAG) 被整合到病毒基因组的必须基因中，这样病毒可以在含有正交系统aaRS/tRNA对及非天然氨基酸(UAA)存在的情况下复制[1-3]。由于宿主不包含特殊的aaRS/tRNA对，病毒只能经历一个周期的感染，不能复制。这一技术最近已应用于HIV-1[1,3]流感病毒A[2]以及寨卡病毒[4]疫苗的研究。流感病毒的动物实验证明，该疫苗效果理想，兼具治疗和预防功能并且能激发强大的体液免疫和细胞免疫。

然而，密码子拓展技术的实施需要特殊的氨酰tRNA合成酶，只催化非天然氨基酸与与其配对的tRNA结合，而不参与细胞内源的tRNA与氨基酸结合。同时需要特殊的人工合成的非天然氨基酸，病毒的组装过程复杂，对UAA的大小与结构有严格要求，必须与该位置原有的氨基酸相似，这使得在活的病毒蛋白中包含进UAA富有挑战。目前应用较多的正交系统包括大肠杆菌中获得的tRNA^Tyr-tyrosyl-tRNA合成酶对(TyrRS)[5]以及古菌中tRNA^Pyl-pyrrolysyl-tRNA合成酶对(PylRS)等[6-8]，它们只在UAG琥珀密码子中插入UAA。

综上所述，密码子拓展技术应用在正交对的选择，突变位点的选择以及底物的选择上仍存在各种各样的挑战[1]。

参考文献：

[1]WANG N,LI Y,NIU W,et al.Construction of a live-attenuated HIV-1vaccine through genetic code expansion[J].Angew Chem Int Ed Engl.2014,53(19):4867-4871.

[2]SI L,XU H,ZHOU X,et al.Generation of influenza A viruses as livebut replication-incompetent virus vaccines[J].Science.2016,354(6316):1170-1173.