[发明专利]抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用

说明书

本发明公开了抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用，所述单克隆抗体SZ176属于IgG1亚类抗体，由杂交瘤细胞株SZ176(3C1)产生；其中，杂交瘤细胞株SZ176(3C1)的保藏编号为CCTCC NO:C2019273；所述单克隆抗体SZ176能够与重组人VWF D1D2区蛋白特异性结合。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本申请所述单克隆抗体能特异性识别血浆中的VWFpp，并结合酶标记方法构建血友病分型诊断或内皮细胞损伤相关疾病的诊断的方法，较以往现有技术而言不仅节约了时间，且对检测及其的要求不高，便于在各实验室和临床上应用；(2)本申请构建的试剂盒利于推广和运用，产业化后可从正规渠道获得，对国内本领域的研究和临床运用提供了便利。

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及一种单克隆抗体，尤其涉及抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用。

背景技术

血管性血友病因子(Von Willebrand factor，VWF)是血浆里参与止血和凝血过程的重要血浆膜糖蛋白，其既能介导血小板粘附于损伤血管壁上，又是凝血因子(FactorVIII，FVIII)的载体，能稳定和保护FVIII不被降解，延长FVIII的半衰期。VWF在内皮细胞和巨核细胞中表达，合成的VWF离开内皮细胞之前，会经过许多翻译后修饰，包括二聚化、糖基化、异二聚体的聚合、前导肽的切割以及硫基化修饰。大部分合成的VWF是通过组成型途径分泌，其余的则储存于内皮细胞的魏伯尔-帕拉德小体(Weibel-Palade body，WPB)和血小板的α-颗粒中。组成型释放的部分VWF蛋白水解不完全，原因在于其多聚化有限，功能较差。相反，通过调节途径释放的VWF是蛋白水解完全加工的，并且由具有生物活性的高分子量多聚体组成。人血管性血友病因子前导肽(VWF propeptide，VWFpp)包含D1和D2两个结构域，含有741个氨基酸，每个D区各有32个半胱氨酸，而半胱氨酸可形成链内或者链间二硫键，在VWF多聚化过程中发挥重要作用。VWFpp在VWF转运及分泌中的作用被广泛研究，但仍有一些功能有待于进一步阐述。研制VWFpp单克隆抗体对研究VWFpp作用机理及功能是一种良好的工具。

因此研制抗人VWFpp单克隆抗体，建立有效的检测VWFpp的方法至关重要。目前国际上VWFpp的检测主要采用来自荷兰阿姆斯特丹的试剂盒，由于价格昂贵，且属于临床检测试剂盒，在国内没有正规渠道可以获得，不利于推广和运用，严重影响了国内在这一领域的研究和临床上的运用。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明通过真核表达系统获得人血管性血友病因子前导肽VWF D1D2区蛋白和针对该区域的单克隆抗体，该抗体能够特异性识别血浆中的VWFpp，而不识别成熟的不含前导肽的VWF，从而通过对该抗体的检测构建血友病分型诊断或内皮细胞损伤相关疾病的诊断的方法；鉴于此，本发明提供了抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用。

技术方案：抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176，所述单克隆抗体SZ176属于IgG1亚类抗体，由杂交瘤细胞株SZ176(3C1)产生；其中，杂交瘤细胞株SZ176(3C1)的保藏编号为CCTCC NO:C2019273；所述单克隆抗体SZ176能够与重组人VWF D1D2区蛋白特异性结合。

所述杂交瘤细胞株SZ176的制备方法如下：

(1)使用重组的人血管性血友病因子VWF前导肽(D1D2区)蛋白作为免疫原，以常规方法免疫Balb/C小鼠；

(2)获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

(3)应用ELISA法和Western免疫印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株SZ176(3C1)。