[发明专利]一种基于磁性纳米晶体酶制剂的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂比色检测方法

权利要求书

1.一种基于磁性纳米晶体酶制剂的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂比色检测方法，其特征在于：

通过一步合成法将磁性Fe₃O₄纳米颗粒MNPs、AOPP除草剂水解酶QpeH、乙醇氧化酶AOx同时包埋于ZIF-8晶体内，制备磁性纳米晶体酶制剂QpeH/AOx@mZIF-8，将其作为生物酶传感器通过比色法检测环境样品中的AOPP除草剂残留；包括如下步骤：

步骤1：磁性Fe₃O₄纳米颗粒MNPs的合成

在圆底烧瓶中加入6.5g FeCl₃·6H₂O和3.342g FeSO₄·7H₂O，完全溶解于去离子水中，将体系加热至50℃并在真空状态下搅拌30min，然后将12.5mL氨水快速加入体系中并升温至75℃，磁力搅拌1h，然后加入12.5mL 1.5mol L^-1柠檬酸三钠，升温至85℃并搅拌1.5h，待反应完成后，收集Fe₃O₄纳米粒子，然后依次用乙醇和去离子水洗涤，真空干燥；

步骤2：AOPP除草剂水解酯酶QpeH的提取和纯化

将含有qpeH基因原核表达质粒pET-29a-qpeH的大肠杆菌BL21(DE3)接种于10mL液体LB培养基中，37℃、220rpm下振荡培养过夜，然后按1％的量转接到2L液体LB培养基中，加入100μL卡那霉素在37℃、220rpm继续培养3h，使OD₆₀₀达到0.6，加入2mL IPTG后置于22℃、160rpm的恒温振荡培养箱中诱导过夜；将诱导培养后的菌液在7000g、4℃离心10min收集菌体，将菌体洗涤三次后用100mLpH 8.0的TE缓冲液将菌体重悬，用ATS高压均质机在4℃、800Pa下破碎15min，然后在10000g、4℃离心20min，取上清进行蛋白纯化；

步骤3：纳米晶体酶制剂QpeH/AOx@mZIF-8的合成

先配制0.4mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和1.25mol/L的2-甲基咪唑溶液，将20mg MNPs重悬于2mL去离子水DI中，超声波脱气15min；酯酶QpeH、AOx溶液分别稀释至终浓度15mg/mL和5mg/mL；将2mLMNPs重悬液和10mL 2-甲基咪唑溶液倒入烧杯中，立即加入1mL的Zn(NO₃)₂溶液和酯酶QpeH、AOx溶液，室温下磁力搅拌30min，6000rpm室温离心10min，用50mM PBS洗涤沉淀，真空冷冻干燥即获得纳米晶体酶制剂QpeH/AOx@mZIF-8；

步骤4：AOPP的检测

将QpeH/AOx@mZIF-8作为生物酶传感器通过比色法检测环境样品中的AOPP除草剂残留。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤2中，酯酶QpeH的纯化过程包括如下步骤：

1)用10×柱体积Ni-Native-0缓冲液洗涤镍柱；

2)将提取的酯酶QpeH用0.45nm滤膜过滤，进一步去细胞碎片，防止堵塞镍柱，控制上柱的流速为0.5mLmin^-1；

3)用20×柱体积Ni-Native-10缓冲液平衡镍柱，使其OD₂₈₀降到小于0.04，其流速为1.0mL/min；

4)分别依次用5×柱体积洗脱缓冲液Ni-Native-20、Ni-Native-50、Ni-Native-100、Ni-Native-250洗脱酯酶QpeH，流速为1.0mLmin^-1，并依次收集不同浓度的QpeH洗脱液；

5)用15×柱体积、浓度为0.5M NaOH清洗树脂30min；

6)用10×柱体积、50mM PBS重新平衡树脂，并用25％的乙醇存储；

7)纯化后的酯酶QpeH，用TE透析48h去除过多的离子和咪唑，再用PEG 20000浓缩至10mL；4℃保存，并用Bradford法测定酯酶QpeH的蛋白浓度。