[发明专利]一种载体系统、制备猪成纤维细胞和基因编辑猪的方法

说明书

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种载体系统、制备猪成纤维细胞和基因编辑猪的方法。所述载体系统包括CD163基因敲除载体和MSTN基因敲除载体，所述CD163基因敲除载体包括载体骨架以及连接到该载体骨架上的核苷酸序列SEQ ID NO：1；所述MSTN基因敲除载体包括载体骨架以及连接到该载体骨架上的核苷酸序列SEQ ID NO：2。本发明载体系统和方法具有降低基因操作难度、提高敲除效率，在短时间内快速将CD163基因和MSTN基因敲除的优点。本发明方案无需药物筛选，不带有外源筛选标记，具有较为简便的细胞筛选流程。可以一次性获得双基因缺失的细胞系，大大缩短了双/多基因编辑动物的制备流程。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种载体系统、制备猪成纤维细胞和 基因编辑猪的方法。

背景技术

猪生殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 是由猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的以猪厌食、发热，妊娠母猪早产、晚期流产、死胎、弱胎 和木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪和生长猪的呼吸系统疾病和高度死亡性为主要特 征的一种高度接触性传染病。因该病在临床上表现为耳部皮肤紫绀，所以又被 称为“蓝耳病”。

PRRSV在体内主要感染分化良好的猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolarmacrophages，PAM)。PRRSV侵染靶细胞的先决条件是与宿主细胞吸附，而宿 主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的。研究发现，硫酸乙酰肝素 (Heparin Sulphate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)和CD163(Cluster of Differentiation 163)分子是PAM上存在的能与PRRSV结合的三个重要受体分子。 其中，CD163是一种富含半胱氨酸的清道夫受体，是典型的Ⅰ型糖基化蛋白， 也是一种巨噬细胞分化的抗原，分子大小是130kD，固又被称为M130蛋白。 CD163起初是作为巨噬细胞和单核细胞的特异性鉴别蛋白质被认识的，在肺、 脾脏、肝脏、淋巴集结和胸腺组织的巨噬细胞中都有表达。有研究表明，在PRRSV 非易感细胞系(如BHK-21和PK-15)中转染表达CD163分子可以使这些细胞系感 染PRRSV并在细胞内产生子代病毒粒子，抗人CD163的抗体可以阻断PRRSV 的感染，表明CD163是该病毒的必需受体。CD163蛋白结构域SRCR5是病毒 感染细胞所必需的，而氨基端的4个SRCR和胞质尾部是非必需的，其中SRCR5 结构域正是由CD163第7外显子所编码。因此，研究CD163基因修饰猪可以为 CD163受体是否是PRRSV感染过程中的重要角色提供必要证据。

本发明的另一方面涉及到猪的肌肉产量。肌肉的生长受到多种因素的调控， 其中肌生成抑制素起着主要的负调控作用。肌生成抑制素(Myostatin，MSTN) 或生长分化因子-8(GDF-8)，属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族，是肌肉 的主要负调控因子。敲除肌生成抑制素基因的小鼠肌纤维发生广泛性的增生和 肥大，骨骼肌量显著增加，平均体重超过正常小鼠的261％，但不存在其他表型 差异。而且肌生成抑制素基因敲除小鼠肌量增加的表型可终生维持，年老的肌 生成抑制素基因敲除鼠比对照鼠肌肉量与肌力都增加。

在养猪业中，产肉率提升和抗病性能提升都是产业的重要需求，这些性状 也是传统选择性育种的难点之一。本发明采用基因工程改造技术对种猪相关性 状的对应基因位点进行定向修饰，建立一种快速简易的多基因同时编辑方案， 一次性地赋予动物多方面的表型，为建立优势种猪育种材料提供便捷方案，对 养殖业具有积极推动作用。

基于此，本发明建立一种可以快速、准确、有效地同时敲除猪CD163基因 和MSTN基因的方法，获取敲除猪CD163基因和MSTN基因的猪成纤维细胞 或猪在研究提升猪蓝耳病抗性、提高猪的瘦肉率以及猪的新品种培育具有重要 的意义。

发明内容