[发明专利]一种应用于钙离子成像的斑马鱼心脏特异标记品系的建立

说明书

本发明涉及基因敲入技术领域，公开了一种应用于钙离子成像的斑马鱼心脏特异标记品系的构建方法。该方法使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将编码钙离子浓度指示剂的GCaMP5G蛋白的基因编码序列敲入野生型斑马鱼myl7基因的7号外显子内。方法内容包括：确定将GCaMP5G基因序列敲入斑马鱼myl7基因的7号外显子的特异性靶位点以及相应sgRNA的合成，GCaMP5G基因敲入斑马鱼myl7特异位点的序列合成，GCaMP5G基因敲入斑马鱼品系筛选与鉴定。myl7基因的打靶序列如CRISPR/Cas9打靶系统的流程图所示，GCaMP5G蛋白的基因编码序列如图1所示。本发明的斑马鱼品系有助于钙离子成像观察心脏形态发生的整个过程以及心脏收缩和舒张时引起的钙流变化，可以广泛用于心脏疾病的病理研究，并对药物筛选的体外验证提供了良好的基础。

技术领域

本发明属于遗传学和生物技术领域，特别是公开了一种应用于钙离子成像的斑马鱼心脏特异标记品系的构建方法。

背景技术

钙离子成像技术（calcium imaging）是指利用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度的方法。想要对生物体内钙离子的动态变化进行有效的检测，钙离子指示剂的选择显得尤为重要。钙离子荧光指示剂在未结合钙离子前几乎无荧光，与钙离子结合后，荧光强度显著增强。利用这一原理，可以通过指示剂的信号强弱来观察细胞内钙离子浓度水平的变化。目前使用的钙离子指示剂有化学性钙离子指示剂（chemical indicators）和基因编码钙离子指示剂（genetically-encoded Ca²⁺ indicators，GECIs）两类，而GECIs由于其高灵敏度、高亮度和动态荧光范围等优点，已成为应用最为广泛的钙离子检测工具之一，在研究生物体不同组织、系统的生理功能和发育机制方面做出了重要贡献；

GCaMPs是使用最广泛的GECIs之一。GCaMPs是单个绿色荧光蛋白（GFP）、钙调蛋白（CaM）和平滑肌细胞肌球蛋白轻链激酶片段M13融合的产物。GCaMPs具有一个突出的优点，它可以通过特异的启动子和定位序列实现在特定类型细胞或亚细胞结构表达，从而检测目标细胞或亚细胞结构内的钙离子信号的变化，记录生理条件下或给予外源性刺激下不同细胞的反应方式、信号的起源和传递。应用于钙离子成像的斑马鱼心脏标记品系的建立，是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将GCaMP5G敲入野生型斑马鱼myl7基因7号外显子上，通过体式荧光显微镜、PCR、测序鉴定斑马鱼基因型，从而建立的一种新的斑马鱼心脏标记品系。这种品系可以研究斑马鱼心脏传导系统的发育，根据荧光反应的变化分析某些传导缺陷引起的心律失常的成因和机制。另外，此品系的建立对于研究其他钙离子参与的疾病、分析疾病发生发展的基础和病理生理机制提供了良好的动物模型，也为探讨药物的生理和药理学机制、评价新药的药理作用和毒性提供了有效的理论依据，在医学上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用于钙离子成像的斑马鱼心脏特异标记品系。斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，该模型能够帮助我们研究人类心脏疾病病理生理机制和进行心脏疾病治疗药物筛选的理想模型；

本发明的另一目的在于提供上述斑马鱼品系的构建方法；

本发明所采用的技术方案，具体按照以下步骤实施：

步骤1、基于CRISPR/Cas9技术构建针对野生型斑马鱼myl7基因7号外显子的特异性sgRNA，所述sgRNA的基因序列如PrimerF所示，待敲入的编码钙离子浓度指示剂的GCaMP5G序列如图1所示；

步骤2、合成一对5’C6氨基修饰引物，5’端修饰引物为myl7基因7号外显子编码区终止密码子前的54 bp及GCaMP5G的5’端22 bp，3’端修饰引物为myl7基因7号外显子编码区终止密码子后的54 bp及GCaMP5G的3’端24 bp，引物序列如PrimerF2、PrimerR2所示；

步骤3、合成两对检测引物：F1、R1引物用以检测靶位点是否有效果，F11、R11用以检测外源DNA序列是否正确插入，两边同源臂是否打靶正确；