[发明专利]一种能够发酵生产宜他霉素的链霉菌cmx-10-19菌株及其应用

权利要求书

1.一株能够发酵生产宜他霉素的链霉菌cmx-10-19菌株，所述的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2021489。

2.权利要求1所述的cmx-10-19菌株在发酵生产宜他霉素中的应用。

3.一种使用权利要求1所述的链霉菌cmx-10-19菌株发酵生产宜他霉素的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)种子培养制备种子液，其步骤为：

将链霉菌cmx-10-19菌悬液融化后，接种于ISP2培养基平板上，28℃培养6～8天；

传代后再一次在ISP2培养基平板上28℃培养6～8天；

将2cm²大小的固体培养物接种至的ISP2液体培养基中，28℃条件下培养，获得种子液；

(2)发酵培养，其步骤为：

将种子液与发酵培养基按照1：15～25的进行接种；

在28℃条件下，培养6～10天；

所述的培养基为M10液体培养基，其配方为：甘油20.0g，糖蜜10.0g，酪蛋白5.0g，CaCO₃4.0g，蛋白胨1.0g，无菌水1.0升；

(3)从发酵液提取宜他霉素粗提物，其步骤为：

液体发酵液冷冻干燥后，首先用甲醇萃取；

萃取液离心后将上清液上样至ODS固相萃取板；

然后加入甲醇进行两次洗脱，流出物合并，挥干溶剂后，即得含宜他霉素粗提物；

(4)反相色谱级联半制备HPLC精制宜他霉素粗提物得宜他霉素，其步骤为：

首先使用Flash反向色谱分离宜他霉素粗提物，

使用水为A相，乙腈为B相，使用梯度洗脱法进行洗脱，洗脱程序为：0-50min，50％B～100％B；得到初纯宜他霉素；

然后使用HPLC分离初纯宜他霉素，

使用水为A相，乙腈为B相，两相均添加了0.1％甲酸以改善色谱行为，流速为2.5mL/min，洗脱程序为：0-50min，62％B～100％B；得宜他霉素。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，

步骤(1)所述的制备种子液的步骤中，每次在ISP2培养基平板上的培养的时间为7天，在液体培养基中培养时间为48小时。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，

步骤(2)所述的发酵培养中，

种子液与发酵培养基的比例为1：20，发酵培养时间为9天。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，

步骤(3)所述的从发酵液提取宜他霉素的步骤中，

萃取冷冻干燥后的发酵液的甲醇用量等于步骤(2)的发酵液的量，洗脱时的甲醇用量为萃取用甲醇量的1/3；所述的离心的参数为4500rpm离心10分钟。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，

步骤(4)所述的反相色谱级联半制备HPLC精制宜他霉素粗提物得宜他霉素中，

使用Flash反向色谱分离宜他霉素粗提物时，

两相均添加了0.1％甲酸以改善色谱行为，色谱柱为RediSep Column，12g C18，流速为5mL/min，洗脱程序为：

0min-10min,50％B；

10min-15min,50％B-60％B；

15min-25min,60％B；

25min-30min,60％B-70％B；

30min-40min,70％B；

40min-45min,70％B-100％B；

45min-50min,100％B。

8.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，

步骤(4)所述的反相色谱级联半制备HPLC精制宜他霉素粗提物得宜他霉素中，使用HPLC分离初纯宜他霉素时，

半制备色谱柱为Dr.Maisch GmbH C18 5μm 250×10mm，柱温箱为30℃，

洗脱程序为：

0min-45min,62％B；

45min-50min,62％B-100％B；

50min-60min,100％B；

60min-65min,100％B-62％B；

宜他霉素峰的保留时间(Rt)为：41min。