[发明专利]一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法。一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，包括如下步骤:取待提取衣藻细胞消化细胞壁，得到悬浮液1；将悬浮液1中原生质体富集；将原生质体破碎后分离叶绿体。步骤(1)中的消化细胞壁的方法为：将待提取衣藻细胞悬浮于细胞壁酶解缓冲液中，消化的条件为：23‑25℃下，避光10min以上；可选的，还包括终止消化细胞壁的步骤。实验证明，本发明方法操作简单，叶绿体RNA中胞质RNA污染少，纯度高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法。

背景技术

叶绿体作为独特的半自主性细胞器，拥有一套独立的基因组，在其基质中进行DNA复制、转录、蛋白翻译等一系列有限的遗传活动。但是该遗传系统的自主程度有限，与核遗传系统存在着密切的生物学调控机制。因此，提取分离获得高纯度的叶绿体RNA，能为细胞器的RNA研究提供有效的实验材料，对于分析叶绿体内各项生理活动及了解相关分子调控机制具有十分重要的意义。

由于叶绿体在莱茵衣藻细胞中体积占比较大，尤其靠近细胞膜。在破碎细胞进行细胞结构分离过程中极有可能会使细胞内的叶绿体造成严重的损害。同时叶绿体对温度、酸碱度、渗透压等外界环境极其敏感，在提取过程保持低温、pH偏高、等渗透压的稳定外环境无疑增加了提取分离的难度。因此相比其他细胞结构，提取分离到完整且具有生物活性的叶绿体十分困难。目前发表的关于莱茵衣藻叶绿体的分离方法大多直接选用莱茵衣藻的细胞壁缺失型突变体例如CC-400和CC-4326等作为实验藻株。而细胞壁完整的莱茵衣藻需进行前处理，常规细胞破碎的方法常可分为机械破碎和非机械破碎，常用于衣藻叶绿体分离的机械破碎方法有高压匀浆法和针压法，两者都是通过压力变化使液体产生剪切力，作用于细胞从而使得细胞破碎。破碎细胞后再可通过差速离心和密度梯度离心的方法将细胞和各类亚细胞结构分离开来。同时，传统方法提取的叶绿体RNA中存在胞质RNA污染。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中提取的叶绿体RNA中存在胞质RNA污染缺陷，从而提供一种高纯度的衣藻叶绿体RNA的提取方法。

本发明提供一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，包括如下步骤:

一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，包括如下步骤:

一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，其特征在于，包括如下步骤:

(1)取待提取衣藻细胞消化细胞壁，得到悬浮液1；

(2)将悬浮液1中原生质体富集，所得原生质体重悬浮，得到悬浮液2；

(3)将原生质体破碎后分离叶绿体。

可选的，步骤(1)中的消化细胞壁的方法为：将待提取衣藻细胞悬浮于细胞壁酶解缓冲液中，消化的条件为：23-25℃下，避光10min以上；可选的，还包括终止消化细胞壁的步骤；可选的，将待提取衣藻细胞液离心后，收集沉淀，得待提取衣藻细胞；细胞壁酶解缓冲液与取待提取衣藻细胞液的体积比为1:10；待提取衣藻细胞液为：将莱茵衣藻(cc849)接种到培养基中，在温度为25℃，光照强度为50μmol photons/m²/s、光暗比12h:12h的培养箱中，共培养3个光周期，在第四个光周期的4-6h收集衣藻细胞液。

可选的，所述细胞壁酶解缓冲液溶剂为无RNase的ddH₂O，溶质及浓度如下：400mM甘露醇、20mM MES、20mM KCl、1.5％(w/v)的cellulase(纤维素酶)、0.4％(w/v)的macerozyme(离析酶)和0.1％(w/v)BSA，pH为5.7；w/v表示g/mL

可选的，步骤(1)中终止消化细胞壁的方法为在悬浮液1中加入酶解终止缓冲液；细胞壁酶解缓冲液与酶解终止缓冲液的体积比为1:1；