[发明专利]一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法

权利要求书

1.一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：选择合适人群；

步骤二：设置对照组实验；

步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态，及时传代；

步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；

步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2等胚胎干细胞基因的表达；

步骤六：观察实验结果，并对实验数据进行研究。

2.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。

3.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤二中，将分离出的细胞或微小组织放置在添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系的细胞培养瓶内，细胞培养瓶内放置有细胞培养液。

4.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤二中，采用添加了鱼卵蛋白的无血清培养基(含20％SR，2mol/L-glutamine，1％NEAA，0.1mol/Lmercap-toethanol和5ng/mLbFGF的knockout-DMEM培养液)对细胞进行扩增，按照相同的细胞密度，采用经典的间充质干细胞分离方法，即有血清培养基(含10％NCS的DMEM/F12培养液)对细胞进行扩增。

5.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤四中，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞。

6.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤五中，取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况。

7.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤六中，使用TRIZOL提取总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察PCR产物，并对结果进行照相。

8.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤六中，观察图像结果，对比胚胎样干细胞和间充质干细胞形态特征，并记录数据。